Comment obtenir de la vanilline naturelle à partir de l’acide ferulique?

Résumé: la vanilline est la troisième plus grande épice comestible dans le monde, et avec l’amélioration de people' S conscience de la santé, le dosage de vanilline naturelle augmente d’année en année. Dans cet article, Streptomyces psammoticus OMK-4 a été utilisé comme bactérie de fermentation pour la production de vanilline, et les conditions de fermentation ont été tracées et optimisées dans un fermenteur à réalimentation automatique de 30 l. Les conditions optimales de fermentation ont été déterminées par l’optimisation de la quantité d’inoculum, de la température d’incubation, du pH d’incubation, de l’oxygène dissous et d’autres conditions de fermentation, et la puissance a atteint 25,3 g/L. Les résultats ont été les suivants.

La vanilline, scientifiquement connue sous le nom de 4-hydroxy-3-méthoxybenzaldéhyde, se trouve dans le baume péruvien, l’huile de bourgeon de girofle, la vanille, le café, les raisins et l’eau-de-vie, et a une odeur de vanille et un goût sucré [1-3]. La vanilline est une saveur importante qui peut être utilisée comme exhausteur d’arôme, agent aromatisant, harmonisateur et booster d’arôme dans les aliments, le tabac, les cosmétiques et l’agriculture.  En raison de sa vaste gamme d’applications, la demande annuelle de vanilline augmente à un taux de 10%, mais la production nationale n’est toujours pas suffisante pour répondre à la demande sur les marchés nationaux et internationaux [4-5].

La vanilline peut être produite par synthèse chimique, extraction, biotransformation et méthodes enzymatiques [6]. Avec l’augmentation des personnes' S la conscience de la santé, la demande et le prix de la vanilline naturelle ont augmenté continuellement, et il est devenu un sujet de recherche brûlante ces dernières années [7]. Cependant, la quantité limitée de vanilline naturelle extraite des plantes est loin de répondre à la demande du marché, et la charge environnementale provoquée par la synthèse chimique devient de plus en plus lourde, de sorte que la bioconversion et les méthodes enzymatiques sont devenues la principale force dans la production de vanilline [8-9].

Cet article adopte la méthode de bioconversion pourProduire de la vanilline par le métabolisme microbienAvec l’acide ferulique comme substrat, qui a un cycle court, un rendement élevé et moins de pollution, et après optimisation des conditions de fermentation, les conditions pour l’industrialisation sont disponibles.

1 matériaux et méthodes

1.1 déformations d’essai

Streptomyces psammoticus OMK-4 a été déposé dans la salle de souche de Xiamen Omicron Biotechnology Co.

1.2 principaux instruments

Fermenteur de recharge automatique de 30 L, Shanghai Baoxing Biotechnology Co., Ltd; Chromatographie liquide à haute performance (HPLC), Agilent, 1260 ; Biocapteur, académie des Sciences de Shandong, SBA-40E; Spectrophotomètre, Shimadzu, UV-1780; PH mètre, Mettler, S-210S.

1.3 médias culturels

1.3.1 supports de semence

Amidon Soluble 1,0 ~ 3,5 g/L, phosphate dihydrogène de potassium 0,1 ~ 0,5 g/L, urée 0,1 ~ 0,3 g/L, sulfate de magnésium 0,05 ~ 0,10 g/L, carbonate de calcium 0,1 ~ 0,3 g/L, poudre de lixiviation de levure 0,1 ~ 1,0 g/L, sirop de maïs 0,1 ~ 1,0 g/L, sulfate d’ammonium 0,1 ~ 0,6 g/L, acide férolique 0,2 g/L.

1.3.2 milieux de Fermentation

Amidon Soluble 2,0 ~ 5,0 g/L, phosphate dihydrogène de potassium 0,1 ~ 0,3 g/L, urée 0,1 ~ 0,5 g/L, sulfate de magnésium 0,05 ~ 0,1 g/L, carbonate de calcium 0,5 ~ 2,0 g/L, extrait de levure 0,1 ~ 1,0 g/L, sulfate d’ammonium 0,1 ~ 0,5 g/L et acide avic 2,0 g/L. Voici quelques exemples de l’amidon soluble utilisé dans la préparation de l’échantillon.

1.4 méthodes de culture

1.4.1 culture des semences

Dans des conditions aseptiques, la spatule d’inoculation a été utilisée pour insérer un cercle complet de souches bien cultivées à partir de l’obturateur solide cultivé dans le milieu de semence stérile, le pH initial du milieu de semence était de 5~8, et les organismes ont été cultivés au stade de croissance logarithmique dans des conditions de température d’incubation de 28~35 ℃ et de vitesse de rotation de 200~500 r/min.

1.4.2 cultures de fermentateurs

Le liquide de semence cultivé au stade de croissance logarithmique a été ajouté au milieu de fermentation dans des conditions aseptiques à un volume de 5 à 15%; Le pH initial du milieu de fermentation était de 7,2 ~ 7,8, et la fermentation a été effectuée pendant 70~120 h dans des conditions de température de 30~40 ℃, de vitesse de barattage de 200~500 r/min et de taux d’aération de 1︰ 0,5. La fermentation a été effectuée dans les conditions de 1︰ 0,5, et la fermentation a été effectuée dans les conditions de 1︰ 0,5.

1.5 optimisation des conditions de fermentation

Effet du pH sur la fermentation de la vanilline

Le pH du processus de fermentation affecte non seulement l’existence du substrat, mais est également en corrélation avec la pression osmotique des cellules, qui affecte l’entrée et la sortie du substrat dans et hors des cellules. Afin d’obtenir le pH optimal de fermentation, l’effet de différents contrôles du pH sur la puissance de la vanilline a été étudié et les méthodes spécifiques ont été les suivantes: (1) le pH de l’ensemble du processus de fermentation a été contrôlé à 7,5; (2) le pH du processus de fermentation a été contrôlé à 7,5 pendant 0 à 12 heures, puis le pH du processus de fermentation subséquent a été contrôlé à 8,0;

(3) le pH a été contrôlé à 8,0 tout au long du processus de fermentation.

1.5.2 effet de l’oxygène dissous surFermentation vanilline

Des expériences ont montré que le contrôle de l’oxygène dissous dans le bouillon de fermentation a une grande influence sur la croissance des bactéries et l’accumulation des produits dans le stade ultérieur. Il est donc nécessaire de contrôler l’oxygène dissous dans le processus de fermentation. Afin d’obtenir un contrôle optimal de l’oxygène dissous dans la fermentation, on a étudié les effets de différents témoins de l’oxygène dissous sur la croissance des bactéries et l’accumulation de produits. Les expériences suivantes ont été effectuées: 0%, 10%, 20%, 30%, 40% et 50% de l’oxygène dissous ont été contrôlés respectivement par la vitesse de rotation et l’aération.

1.5.3 effet de la température d’incubation sur la fermentation de la vanilline

La température a un effet important sur la production microbienne, la synthèse et l’accumulation de métabolites. Une température élevée peut accélérer la croissance et le métabolisme des micro-organismes, mais une température trop élevée peut également entraîner le déclin prématuré de l’organisme et affecter l’accumulation de produits. Il est donc important d’optimiser la température de la déformation [10]. Afin d’obtenir la température optimale de culture de fermentation, nous avons étudié l’effet de différentes températures de culture sur la croissance des bactéries, et comparé la croissance des bactéries et l’accumulation de vanilline en contrôlant les températures à 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃ et 40 ℃, afin d’obtenir la méthode optimale de contrôle de la température. 

1.5.4 effet de la quantité d’inoculum sur la fermentation de la vanilline

Des quantités différentes d’inoculum ont des effets importants sur la croissance normale et le métabolisme des bactéries, un manque d’inoculum conduira à une croissance lente des bactéries, la période de retard dela croissance des bactéries sera plus longue et la complexité des métabolites secondaires ne favorise pas l’accumulation des produits ultérieurs; Une trop grande quantité d’inoculum entraînera la prolifération des bactéries, et le milieu augmentera l’épuisement des nutriments, et l’oxygène dissous ne sera pas en mesure de répondre aux exigences de contrôle [11]. Par conséquent, il est important de contrôler la quantité d’inoculum de fermentation. Afin d’obtenir le niveau optimal d’inoculum de fermentation, les effets des différents niveaux d’inoculum sur la croissance des bactéries ont été étudiés, et la croissance des bactéries et l’accumulation de vanilline ont été comparées par cinq gradients de niveaux d’inoculum de 1%, 3%, 5%, 7% et 9%, afin d’obtenir le niveau optimal d’inoculum.

1.6 méthodes d’analyse

Détermination de la concentration bactérienne: prélever la solution de culture et la diluer avec de l’eau distillée pendant un certain nombre de fois, puis bien mélanger et mesurer l’absorbance à 620nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

Détermination du sucre résiduel: Ferrin' le titrage par réactif S a été utilisé [12]. Détermination de la teneur en vanilline: HPLC [13].

2 résultats et Discussion

2.1 effet du pH sur la fermentation de la vanilline

Comme le montre la figure 1, la croissance des bactéries était meilleure à pH 7,5, avec un OD620 maximum de 0,62; La croissance des bactéries était pire à pH 8,0, avec un OD620 maximal de 0,41; Et la croissance des bactéries était meilleure à pH 7,5 pendant 0-12 h, avec un OD620 maximum de 0,64 au contrôle subséquent de 8,0. Par conséquent, la croissance des bactéries était facilitée par le pH 7,5, et la croissance des bactéries était plus lente lorsque le pH était plus élevé. Plus le pH est élevé, plus la croissance des bactéries est lente. D’après le contrôle segmenté du pH, on peut constater que la croissance des bactéries n’a pas été affectée lorsque le pH a été ajusté à 8,0 au stade ultérieur, de sorte que les bactéries avaient essentiellement atteint le stade de stabilisation à environ 12 h de fermentation.

La figure 2 montre que la concentration en vanilline était de 13,200 g/L, 16,988 g/L et 14,500 g/L sous différents paramètres de pH, et que le taux de conversion de la vanilline était le plus élevé à pH 7,5 de 0 à 12 h, puis à pH 8,0, suivi de pH 8,0, et était plus faible à pH 7,5, ce qui peut être dû au fait que l’activité enzymatique était meilleure que celle de pH 7,5 à pH 8,0. Cela peut être dû au fait que l’activité enzymatique à pH 8,0 était meilleure qu’à pH 7,5.

En combinant les Figures 1 et 2, on peut résumer que la croissance des bactéries était meilleure à pH 7,5 et que le taux de conversion enzymatique était plus élevé à pH 8,0. Par conséquent, il a été choisi que le contrôle de la segmentation pendant la fermentation aiderait la croissance des bactéries et obtiendrait une meilleure activité enzymatique.

2.2 effet de l’oxygène dissous sur la fermentation de la vanilline

Comme on peut le voir sur la figure 3, avec l’augmentation de l’oxygène dissous, la concentration de bactéries augmentait, dans laquelle la croissance de bactéries était la plus faible à 0% d’oxygène dissous, essentiellement pas de croissance de bactéries; À 40%~50% d’oxygène dissous, c’était la condition de croissance optimale pour les bactéries, et la croissance des bactéries était la plus élevée, et l’od620 était 0,75. Dans le cas d’une augmentation de l’oxygène dissous, le temps pour les bactéries d’entrer dans la période de croissance logarithmique diminue graduellement, et lorsque l’oxygène dissous atteint 40%~50%, la période d’adaptation pour la croissance des bactéries est la plus courte, et les bactéries peuvent entrer dans la période de croissance logarithmique rapidement, raccourcissant ainsi le cycle de fermentation. Par conséquent, il peut être jugé que la croissance des bactéries a besoin d’une grande quantité d’oxygène, et la croissance des bactéries est meilleure quand le niveau d’oxygène dissous est 40%~50%.

La figure 4 montre que l’accumulation de vanilline a augmenté graduellement puis diminué lentement avec l’augmentation de l’oxygène dissous, et que la meilleure accumulation de vanilline a été constatée à environ 30% d’oxygène dissous, et l’accumulation la plus élevée était d’environ 17,5 g/L. La faible accumulation de vanilline à une faible teneur en oxygène dissous pourrait être due à la mauvaise production des bactéries, à l’enzyme insuffisante ou à la faible teneur en oxygène dissous affectant la vitalité de l’enzyme. Avec l’augmentation graduelle de l’oxygène dissous, l’accumulation de vanilline a graduellement montré une tendance à la baisse, surtout à 50% de l’oxygène dissous, la diminution de la vanilline s’est produite au stade avancé de la fermentation, et on a constaté que l’accumulation d’acide vanillique en tant que sous-produit augmentait graduellement, ce qui était soupçonné d’être dû à l’excès d’oxygène dissous qui a conduit au flux métabolique biaisé vers la production d’acide vanillique. On soupçonne que la teneur en oxygène dissous est trop élevée, ce qui conduit à un biais du flux métabolique vers la production de vanilline. Par conséquent, la teneur en oxygène dissous ne devrait pas être trop élevée à l’étape de production de vanilline pour éviter d’affecter le taux de conversion global.

Comme le montrent les figures 3 et 4, le contrôle de l’oxygène dissous dans le processus de fermentation a été choisi pour être contrôlé par étapes, dans lesquelles l’oxygène dissous a été contrôlé à 40 à 50% au stade de la croissance bactérienne pour assurer l’accumulation du volume de bactéries et pour raccourcisser le cycle de croissance des bactéries, et l’oxygène dissous a été contrôlé à 30% au stade de la production de vanilline afin d’assurer l’accumulation rapide du produit.

2.3 effet de la température d’incubation sur la fermentation de la vanilline

De la figure 5, on peut voir que la croissance des bactéries était lente lorsque la température était basse, et la concentration des bactéries était de plus en plus élevée avec l’augmentation de la température d’incubation, et la concentration des bactéries était la plus élevée lorsque la température a atteint environ 35 ℃, et l’od620 a atteint 0,73; Cependant, la concentration des bactéries a commencé à diminuer avec l’augmentation de la température à 40 ℃, ce qui était probablement dû à la destruction du métabolisme normal des bactéries par la haute température.

Comme on peut le voir sur la figure 6, avec l’augmentation progressive de la température, le taux de conversion de la vanilline était de plus en plus élevé, et les effets de conversion étaient 35 ℃, 30 ℃, 40 ℃ et 25 ℃ dans l’ordre de grandeur; Selon le calcul du taux de conversion de chaque bactérie, les températures optimales étaient de 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃ et 25 ℃ dans l’ordre de grandeur. Les températures optimales étaient 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃ et 25 ℃. On peut constater que le taux de conversion de la vanilline était de plus en plus élevé avec l’augmentation progressive de la température, et le taux de conversion de la vanilline à des températures plus élevées était meilleur que celui de la vanilline à des températures plus basses.

En comparant les Figures 5 et 6, on constate que l’effet de la température sur la fermentation et la conversion de la vanilline de la souche OMK-4 était plus important, et la température de 35 ℃ a été choisie pour la culture de la souche et la conversion de la vanilline.

2.4 effet de la quantité d’inoculum sur la fermentation de la vanilline

De la figure 7, nous pouvons voir les effets de différentes quantités d’inoculum sur la concentration finale des bactéries, cinq quantités différentes d’inoculum peuvent atteindre une concentration d’environ 0,7, parmi laquelle 1% de l’inoculum a un effet pire, la concentration la plus élevée est seulement d’environ 0,65.  Dans les 10 premières heures, avec l’augmentation dela quantité de souche, le délai de fermentation a été évidemment raccourci, comparé à 1% et 9%, le délai a été évidemment raccourci d’environ 6 h. D’après la figure 8, on peut voir que 9% de l’inoculum était plus efficace que 1% de l’inoculum. La figure 8 montre que la quantité d’inoculum de 9% était manifestement inférieure à celle des quatre autres doses d’inoculum, probablement parce que les bactéries étaient principalement fournies au cours du processus de culture et que la vitalité enzymatique serait réduite avec l’augmentation de la concentration des bactéries. Par conséquent, la quantité d’inoculum ne devrait pas être trop importante dans le processus d’inoculation. En comparant la quantité d’inoculum de 1%, 3%, 5% et 7%, le taux de conversion de la vanilline était légèrement plus élevé que les quatre autres quantités d’inoculum, et la quantité de conversion la plus élevée était de 17,21 g/L, 17,23 g/L, 18,05 g/L et 17,27 g/L. Compte tenu des résultats des figures 7 et 8, la quantité optimale d’inoculum de 5% a finalement été retenue.

3 Conclusion

Les conditions optimales de fermentation obtenues à partir de l’optimisation du fermenteur auto-rechargeant 30L étaient: pH 7,5 et oxygène dissous 40%~50% de 0 à 12 h, puis pH 8,0 et oxygène dissous 30%; La température de fermentation était de 35 ℃ tout au long de la fermentation, et la quantité d’inoculum était de 5%. La température de fermentation était de 35 ℃, et la quantité d’inoculum était de 5%. La fermentation a été effectuée dans les conditions optimales pendant 36 h, et la puissance finale de la vanilline a atteint 25,3 g/L, ce qui est un bon résultat dans l’expérience pilote.

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