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japonaisComment synthétiser l’extrait de Ginkgo acide ginkgolique?
Ginkgo bilobA aL. is Le conseil des ministresoldest living tree species on Le conseil des ministresplanEt etEt en plusis known as Le conseil des ministres“golden living fossil”. As a uniqueeconomic gymnosperm dansChina, it has multiple values as food (white fruit), medicine (leaves Et en pluswhite fruit) Et en plusornamental plants. Ginkgo nuts (seeds) are a famous health-promoting dried fruit dansChina. As a food avecmedicinal properties with high nutritional value, the ginkgolides contained dansit are potential actifingredients against the 2019-nCoV virus[1]. Ginkgo biloba leaves are rich dansflavonoids Et en pluslactones. Extraction De laGinkgo biloba (EGB) with acetone-water as the extracting agent can further enrich the two active substances À propos deeffectively treat cardiovascular Et en pluscerebrovascular diseases [2]. Ginkgo biloba is a world-famous ornamental tree for landscaping with its unique leaf shape, golden leaf color Et en plusupright tree shape. At present, ginkgo has been extensively developed dansthe pharmaceutical, food, cosmetics, bonsai and timber industries, and is one De lathe key economic tree species for the current and future revitalization De lathe rural economy and the construction De laa beautiful China.
Depuis les années 1970, la Chine et#39; S ressources de ginkgo ont connu une croissance rapide, et les ressources existantes représentent plus de 80% du monde' S total. Les Ginkgo sont répartis dans toutes les provinces (y compris celles introduites d’autres endroits), à l’exception du Hainan, du Heilongjiang et de la Mongolie intérieure. Actuellement, la superficie cultivée de ginkgo en Chine est de plus de 333.300 hm2, avec une production annuelle d’environ 11.000 tonnes de noix de ginkgo et 10.000 tonnes de feuilles vertes séchées. La valeur de production annuelle de l’industrie primaire de la culture du ginkgo est d’environ 2 milliards de yuans, et l’industrie secondaire de la transformation du ginkgo et de la production pharmaceutique (médecine des feuilles de ginkgo) vaut plus de 10 milliards de yuans.
Cependant, environ 30 000 tonnes de couches extérieures sont rejetées chaque année en raison de la production. Zhang Xinhui et al. [3] ont montré que l’enveloppe extérieure de la graine contient des substances actives telles queginkgolic acid, flavonoids, terpene lactones and polysaccharides. Itokawa et al. [4] showed that ginkgolic acid is another important active substance dansginkgo biloba, dansaddition À propos deginkgolide and ginkgoflavone. It has bactericidal, bacteriostatic, anti-inflammatory, anti-viral, insect repellent and insecticidal effects, and is De lagreat value for development. Therefore, the large amount De ladiscarded outer seed coats not only pollutes the environment but also causes a waste of resources.
Dans les années 1970, Gellerman et al. [5-7] ont détecté l’acide phénolique ginkgolide dans les feuilles de ginkgo, les graines immatures et les couches de graines externes matures. Des mesures quantitatives ultérieures ont montré que le ginkgolide est concentré dans les couches extérieures matures de graines. Wang Jie et al. [8] et Li Hongqing et al. [9] ont utilisé la spectrométrie de masse pour identifier quatre acides ginkgoliques et deux ginkgolides provenant d’extraits acides de ginkgo. La recherche médicale moderne a prouvé que les ginkgolides ont une certaine toxicité allergénique et cytotoxicité, peuvent résister à la croissance de bactéries et de champignons, et ont pour effet de tuer les ravageurs.
Des expériences de culture au champ ont prouvé que les ginkgolides peuvent être développés en tant que biopesticides, et ils peuvent être utilisés dans un large éventail de domaines tels que la médecine et les cosmétiques à l’avenir. Cependant, par rapport à des substances ayant des activités pharmacologiques claires telles que les flavonoïdes du ginkgo et les lactones terpènes, la voie de biosynthèse, le mécanisme de régulation et l’efficacité dérivée de l’acide ginkgolique n’ont pas été étudiés en profondeur, ce qui a ralenti la recherche et le développement de techniques de biologie moléculaire pour inhiber la synthèse de l’acide ginkgolique et l’application technique de la fermentation pour produire des rendements élevés de l’acide ginkgolique. Entravant ainsi le développement de l’industrie du ginkgo.
Dans ce contexte, l’auteur résume les recherches fondamentales sur l’activité biologique des ginkgolides au cours des dernières années, décrit les voies de synthèse des ginkgolides, qui se compose de synthèse d’acides gras et de synthèse de polykétide, résume le mécanisme catalytique des enzymes clés impliquées dans la synthèse, et envisage l’orientation future de la recherche, dans le but de fournir une référence et un soutien théorique pour les recherches ultérieures sur les ginkgolides.
1 activité biologique des ginkgolides
L’acide Ginkgolide appartient à la famille des lipides phénoliques, qui a quatre catégories principales: les alkylphénols, les alkylrésorcinols, les acides anacardiques et les alkylcatéchols [10]. Il s’agit d’une classe de métabolites secondaires chez les plantes. Différentes espèces de plantes peuvent contenir des substances phénoliques uniques. Leur fonction physiologique principale est de résister aux stress biotiques et abiotiques.
1.1 composition du Ginkgolide et propriétés physiques et chimiques
Les Ginkgolides sont d’importants métabolites secondaires du ginkgo biloba et appartiennent à la classe des laques. Ils comprennent trois composants: l’acide ginkgolique, le ginkgol et le bilobol [11] [traduction]. L’acide ginkgolique est un acide 2-hydroxy-6-alkényl (alkynyl) benzoïque (figure 1a) avec une longueur de chaîne latérale de 13, 15 ou 17 et un nombre de liaison double de chaîne latérale de 0 à 2. Au total, cinq types ont été isolés et identifiés, à savoir l’acide ginkgolique B, l’acide ginkgolique A, l’acide ginkgolique, l’acide heptadec-1-enylginkgolique et l’acide heptadec-1-dienylginkgolique. Les Ginkgolides sont des 3-alkenylphénols ayant une longueur de chaîne latérale de 15 ou 17 et un nombre de liaison double de chaîne latérale de 1, et il existe deux types au total; Les acides ginkgoliques sont des 5-alkenylrésorcinols ayant une longueur de chaîne latérale de 15 ou 17 et un nombre de liaison double de chaîne latérale de 2 (figure 1b), et il existe deux types au total.
Plants such as géranium(Pelargonium hortorum) in the Geraniaceae family [12] [en] and sumac (Anacardium occidentale) in the Anacardiaceae family [13] also contain urushiolic acids. The alkyl/alkenyl side chain lengths and the number of unsaturated bonds, and so on, but the chemical structure is similar À propos dethat of ginkgolides. Ginkgolic acidesare the main substances in ginkgolides extract, accounting for 90% of the entire acidic extract. The proportions of the five ginkgolic acids are different, mainly including ginkgolic acid (50% content), followed Par:heptadec-1-enyl ginkgolic acid (22%) and ginkgolic acid (20%) [14] (Figure 2). With the development of science and technology, ginkgo acid has been detected in ginkgo leaves, outer seed coats and kernels. The total ginkgo acid content of ginkgo leaves from different varieties (strains) is about 14.5765-23.6813 mg/g [15], and the total ginkgo acid content of mature kernels is about 0.11 mg/g [14]. and the total ginkgolic acid content in the outer seed coat can reach 28.78 mg/g [16].
The melting point of ginkgolic acid is 41-42°C. At room temperature, pure ginkgolic acid is oily or powdery in appearance, and is poorly soluble in polar solvents such as water or ethanol, but easily soluble in non-polar solvents such as light petroleum ether. It precipitates as crystals in saturated petroleum ether solvent [17]. In solution, the hydroxyl and carboxyl groups on the phenolic acid benzene ring ionize to produce a weak acid, which can undergo esterification and saponification reactions. Ginkgolic acid that has undergone esterification or saponification is easier to extract and separate, achieving the effect of purification. The melting point of ginkgolic acid is about 136 °C and the boiling point is about 500 °C. At 200 °C, the carboxyl group on the phenolic acid benzene ring will undergo a decarboxylation reaction to release CO2, which can be separated using the temperature gradient method. Therefore, according to physical and chemical property research, in the processing of ginkgo products, methods such as “hot air cooking”, “ultrasonic-assisted extraction of ginkgo phenolic acid with resin adsorption” and “compatibility of Chinese medicinal herbs” are often used to remove phenolic acids to achieve the purpose of detoxification. Chen et al. [18] latest La rechercheresults show that the laccase immobilized on a new Type de produitof electrospun nanofiber felt can catalyze the degradation of ginkgo phenolic acid. However, the above-mentioned methods for dephenolic acid treatment have disadvantages such as high cost and difficulty of operation, and are not suitable for large-scale detoxification.
1.2 activité biologique des ginkgolides
Les Ginkgolides ont des effets antibactériens, insecticides, allergènes, cytotoxiques et anticancéreux. Leurs diverses activités biologiques peuvent être exploitées dans la production agricole, la santé et d’autres domaines.
1.2.1 effet antibactérien
L’acide de Ginkgo est l’acide 6-alkylsalicylique, qui a une large gamme de propriétés antibactériennes. Il a un effet inhibiteur sur Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, et une variété de bactéries gram-négatives et gram-positives [19-20]. Son extractif acide a un effet inhibiteur sur le champignon du mildiou de la gaine de riz, le champignon du flétrissement de la tomate, le champignon de l’anthracnose de la pomme, le champignon des taches des feuilles de maïs et le champignon de la moisissure rouge, et son effet antibactérien est comparable à celui de certains médicaments antifongiques [21]. Xu Lichun et al. [22] ont montré que 0,1% d’acide ginkgoïque (15:1) avait un taux d’efficacité de 92% dans l’inhibition des champignons, tandis que 0,5% de clotrimazole avait seulement 68% d’efficacité. Muroi et al. [23] ont montré que l’acide ginkgoïque avait un effet synergique avec les médicaments antibactériens standard pour détruire Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, et l’activité bactéricide de l’association était au moins 100 fois plus élevée que celle du médicament unique dans les 48 heures.
1.2.2 effet insecticide
Ginkgolide acid has been shown to have a significant killing effect on aphids, grubs, cabbage moths, spider mites, mulberry ticks, rice borer and other chewing mouthparts insects [20]. In a test to contrôleaphids, Shi Qitian [24] found that the killing effect of ginkgolide acid extract was comparable to that of the pesticide imidacloprid. Deng Yecheng et al. [25] used different polarities of exocarp extracts in contact toxicity tests and found that they had a strong killing effect on the brown planthopper, peach aphid, red spider and cabbage butterfly larvae.
1.2.3 effets allergiques
In 1934, Hill et al. [26] reported that an active substance in ginkgo has a strong erosive effect on the skin. In 1969, Gellermen isolated lacquer phenolic acids from cashew nuts and ginkgo seeds, respectively, and pointed out that they have a strong sensitizing effect on the skin [5]. Cheng Liang et al. [27] [traduction] reported that ginkgolic acid (C15:1) is metabolized to ginkgolide, which is further oxidized to form catechol, causing an allergic reaction. Vincieri et al. [28] showed that ginkgolic acid can inhibit the activity of various dehydrogenases in glucose metabolism. Ahlemeyer et al. [29] found that ginkgo acid has a competitive inhibitory effect on glycerol-3-phosphate dehydrogenase. Some scholars speculate that ginkgolic acid has a bipolar nature (hydrophilic and lipophilic) and can inhibit the activity of enzymes related to the body or organs, therePar:affecting metabolism and causing allergies [30] [en].
1.2.4 cytotoxicité
Le Ginkgolide a des groupes hydrophiles et lipophiles, qui peuvent se lier à la membrane cellulaire à travers la membrane et causer la mort cellulaire. Al-Yahya et al. [31] ont utilisé de l’extrait de ginkgo contenant de l’acide ginkgo pour effectuer un essai de toxicité sur des rats mâles, et les résultats ont montré que l’extrait peut causer la perte de chromosomes tels que les cellules germinales, affectant la fonction reproductive normale des rats. Ahlemeyer et al. [29] ont constaté que l’acide ginkgolide présente une neurotoxicité et peut entraîner la mort de cellules neuroblastomiques de poulet. Ces dernières années, des chercheurs ont mené des études distinctes sur la toxicité de divers acides ginkgo. Jiang et al. [32] ont constaté que l’acide de ginkgo (C15:1) peut causer un stress oxydatif et endommager les cellules du foie des rats en induisant des troubles métaboliques de la purine. Yao et al. [33] ont constaté que la toxicité de l’acide heptadécylidène ginkgo (C17:1) pour les cellules HepG2 est directement proportionnelle au temps et à la dose, eta augmenté la cytotoxicité en mediant le métabolisme du CYP1A et du CYP3A. Des études ont montré que parmi les ginkgolides, l’acide ginkgolique (C13:0), l’acide ginkgolique (C15:1) et l’acide ginkgo heptadécylidène (C17:1) sont plus toxiques, et d’autres acides phénoliques peuvent agir en combinaison avec les trois acides ginkgo pour augmenter la cytotoxicité.
1.2.5 effet anticancéreux
Les Ginkgolides ont une cytotoxicité et peuvent jouer un rôle anticancéreux. Qiao et al. [34] ont constaté que l’acide de ginkgo peut induir l’activation de la protéine kinase activée par le monophosphate-adénosine (AMPK) pour inhiber la prolifération et la migration. Liang et al. [35] ont constaté que l’acide de ginkgo peut inhiber la croissance des cellules cancéreuses gastriques en inhibant la voie de signalisation STAT3/JAK2 régulée par ros. Liu et al. [36] ont montré que l’acide de ginkgo peut bloquer la transition des cellules cancéreuses du côlon de la phase G0/G1 de division cellulaire, conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Des expériences cellulaires In vitro ont montré que l’acide de ginkgo peut inhiber la prolifération et la migration des cellules cancéreuses et activer des enzymes connexes pour favoriser l’apoptose. Et peut devenir un médicament adjuvant anticancéreux pour le traitement de la tumeur à l’avenir.
2 biosynthèse Ginkgolide
In the 1970s, Gellerman from the University of Minnesota in the United States used the 14C labeling method to conduct a preliminary exploration of the ginkgolide acid synthesis pathway. In the 1990s, Walters et al. [37] used gas-liquid chromatography (GLC trapping) to analyze labeled monomethyl esters extracted from liquid chromatography (HPLC), and determined the specific synthetic steps of Urushiol (acide 2-hydroxy-6-alk(en) yl-benzoïque) dans le géranium. Singhal [38] et Narnoliya et al. [39] ont étudié plus en détail les types et les fonctions des enzymes clés dans la synthèse de Urushiol.
2.1 voie de biosynthèse du Ginkgolide
Gellerman et al. [6-7] croient que le cercle aromatique et le groupe alkyl/ alkényle à longue chaîne du ginkgolide sont synthétisés par étapes, selon l’infence expérimentale, il est divisé en trois parties: ① malonyl-CoA et acétyl-coa forment le palmitoyl-CoA libre et l’oléoyl-coa par la synthèse des acides gras; ② acyl-CoA à longue chaîne est synthétisé pour former de l’acide ginkgolique par synthèse de polykétide; ③ l’acide ginkgolique perd le groupe carboxyle de l’anneau benzène et est oxydé et réduit en substances telles que le ginkgol.
Le géranium (Pelargonium hortorum) est une plante de la famille des geraniacées. Ses trichomes ne sécrètent que de l’acide shikimique (homologue de l’acide ginkgoïque), ce qui en fait la meilleure espèce pour étudier la voie de synthèse de l’acide shikimique. Le géranium de Type de produitsauvage sécrète de l’acide shikimique avec une chaîne latérale saturée, tandis que les types résistants aux insectes sécrètent de l’acide shikimique avec une chaîne latérale monoinsaturée (C15:1 et C17:1). Des études ont montré que l’acide urushiol insaturé dans les géraniums est identique dans la structure moléculaire aux deux acides ginkgoliques (acide ginkgolique (C15:1) et acide ginkgolique (C17:1)) sauf pour la différence dans la position de la double liaison. Hesk et al. [12] ont comparé les gènes différentiels et les métabolites des géraniums de type sauvage et résistants aux insectes, et ont révélé le mécanisme moléculaire de la synthèse de l’urushiol. Les chercheurs ont utilisé la technologie RNA-seq pour construire une base de données sur les transcriptomes de l’adnc du géanium, et ont identifié les gènes clés de la synthèse comme étant le gène Polyketide Synthases emon et le gène Stearyl-ACP Desaturase (SAD) au moyen d’une comparaison par annotation génétique et d’une analyse de l’Expression:différentielle. La voie régulatrice de la synthèse du ginkgolide est expliquée en utilisant l’acide ginkgolique (15:1) et l’acide heptadécylideninkgolique (17:1) comme exemples.
2.1.1 synthèse de la chaîne latérale alkylée
La synthèse des ginkgolides est d’abord basée sur la synthèse de l’acide palmitoléique et de l’acide oléique, c’est-à-dire la synthèse de la chaîne côté alkylé (Figure 3). La fermentation du saccharose stocké en phosphoénolpyruvate, le changement allostérique de la pyruvate kinase (pyruvate kinase) pour former du pyruvate du cytoplasme dans le plastide, et la catalyse de la pyruvate déshydrogénase (PDH) pour former l’acétyl-coa constituent la molécule 2C de départ pour les acides gras. L’acétyl-coa est catalysé par l’acétyl-coa carboxylase (ace-tyl-coa carboxylase, ACC) pour former la malonyl-CoA. La Transacylase (TA) remplace la molécule de CoA par une protéine porteuse d’acyle (ACP) pour former la malonyl-ACP. La Malonyl-ACP perd son groupe carboxyle pour devenir acétyl-acp et est condensée dans un cycle par la β-kétoacyl-acp synthase III. Le droit de la famille(KAS III) pour former le matériau de départ 4C acyl-ACP.
4C acyl-ACP est condensé à plusieurs reprises par β-Ketoacyl-ACP synthase I (KAS I) pour former palmitoyl-ACP (C16:0 ACP), qui est ensuite déshydrogénée par δ9-stéaroyl-acp désaturase (SAD) pour former palmitoléic-acp (δ9 C16:1 ACP). Le SAD) est déshydrogéné en acide palmitoléique ACP (δ9 C16:1 ACP), puis catalysé par la kétoacylsynthase II (β-kétoacyl-acp synthase, lcpe, KAS, lcpe) pour former l’acide oléique ACP (δ11 C18:1 ACP). La Palmitoyl-ACP et l’oléoyl-acp dans les plastides sont respectivement déacylées par la thioestérase A (TE/FatA) et la thioestérase B (TE/FatB) pour former des acides gras libres et insaturés [40] [traduction]. Enfin, les acides gras libres sont convertis en palmitoleyl-CoA (δ9 C16:1CoA) et en oléoyl-coa (δ11 C18:1CoA) par l’acyl-coa synthase (ACS) dans la membrane externe du plastide, puis transférés au cytoplasme pour devenir les deux précurseurs importants des acides ginkgoliques.
Cependant, les voies de synthèse des acides gras de l’acide ginkgolique et du géranylgéranyl sont différentes. Les précurseurs de la synthèse de l’acide ginkgolique (C15:1) et de l’acide heptadécylideninkolique (C17:1) sont l’acide palmitoléique (δ9 C16:1) et l’acide oléique (δ11 C18:1), tandis que les précurseurs de la synthèse des 2 chaînes côté monoényle de l’acide oléique sont l’acide palmitoléique (δ11 C16:1) et l’acide oléique (δ13 C18:1). Les acides gras ω-7 communs (acide palmitoléique (δ9 C16 1:1) et acide oléique (δ11 C18 1:1)) peuvent être formés dans de nombreuses plantes sauvages et algues à partir de palmitoyl-ACP (C16 1:0 ACP) par désaturation, polycétone et autres réactions. Schultz et al. [41] ont découvert qu’un nouveau type de désaturase de l’acp du géranyle dans le géranium déshydrogénise l’acide myristique (δ9 C14:1) pour former de l’acide myristique (δ9 C14:1), puis subit des réactions de polycétide et d’autres pour former deux acides gras mono-insaturés (acide palmitoléique (δ11 C16:1) et acide oléique (δ13 C18:1)). Par conséquent, la voie synthétique des acides gras précurseurs de l’acide ginkgolique est plus facile à explorer que celle de l’acide pélargonolique dans les géraniums.
Singhal [38] a identifié et vérifié l’expression de gènes liés à la synthèse d’acides gras mono-insaturés (acide palmitoléique et acide oléique) dans le géranium. Les résultats ont montré que lorsque l’expression génétique des protéines porteuses de l’acyle (pca), des Les synthaseskétoacyle (KASs) et des thioestérases (TEs) dans les tissus était élevée, la teneur en acides gras et en acide ursolique était également élevée. La protéine porteuse d’acyle (ACP) est un support intermédiaire conservé qui est essentiel au processus de synthèse des acides gras. Il travaille avec la désaturase acyl-ACP (AAD) pour désaturer la chaîne acyle, en modifiant le rapport des acides gras saturés et insaturés. Il peut également agir comme une enzyme limitant le taux avec ketoacyl-ACP synthase (KAS) pour réguler le taux de synthèse de l’acide phénolique.
2.1.2 synthèse des anneaux du phytylbenzène
La synthèse du cycle du phytylbenzène est une étape clé dans la formation d’acides phénoliques à partir d’acides gras plus élevés. La voie de synthèse est représentée à la Figure 4. En prenant l’acide gammacérolique (C15:1) à titre d’exemple, le palmitoyl (δ9 C16:1) de la voie des acides gras utilise la malonyl-CoA comme substrat et sous l’action du polykétide Syn- thase emon (PKS emon), quatre atomes de carbone sont ajoutés à l’extrémité acyle par une réaction de condensation en deux étapes; Deuxièmement, le groupe cétone à la position C3 est réduit par la cétone réductase (PKS- ketoacyl-CoA réductase, KR) pour former un groupe hydroxyle, et une double liaison est formée par la déshydratase (pks-déshydratase, DH) retire une molécule d’eau pour former une double liaison; Troisièmement, après condensation et polymérisation, deux atomes de carbone supplémentaires sont ajoutés à l’extrémité acyle. A ce moment, l’ion hydrogène en position C2 se rapprochera du groupe cétone en position C7 pour maintenir la stabilité de la structure intermédiaire du tripeptide 4,15-diène; Quatrièmement, en s’assurant que le groupe cétone à C1 ne décarboxylate pas, le cyclase (PKS-Cyclase) catalyse la cyclisation de l’ion hydrogène à C2 avec le groupe cétone à C7, semblable à une condensation aldol, et une double liaison est formée sous l’action de la déshydratase (pks-déshydratase); Cinquièmement, l’énoyle réductase (pks-énoyle réductase, ER) catalyse la formation d’une double liaison et l’aromatisation du groupe cétone sur l’anneau de carbone hexagonal. Il et le groupe carboxyle C1 forment ensemble la structure de l’acide benzoïque; Enfin, la chaîne latérale monoinsaturée est formée pour produire de l’acide ursolique (C15:1) [37,39].
La polykétide synthase (PKS III) de type III. Le droit de la familleest l’enzyme limitant le taux pour la synthèse des lipides phénoliques (alkylphénols, alkylrésino-cyls, urushiols, alkylcatéchols, etc.) [42]. La Chalcone synthase (CHS) et la stilbène synthase (STS) sont deux des superfamilles les plus représentatives. STS) sont deux des superfamilles les plus représentatives. Ils peuvent catalyser la condensation et la cyclisation des chaînes d’acyle aux positions C1 et C6 (condensation de Claisen) et aux positions C2 et C7 (condensation d’aldol), respectivement, pour former des substances phénoliques. Cependant, les acides uroniques peuvent catalyser la condensation de l’ion hydrogène en position C2 avec le groupe cétone en position C7 tout en conservant le groupe carboxyle en position C1 pour former de l’acide benzoïque. Cette réaction de cyclisationdu polykétide qui retient le groupe carboxyle du cycle benzène est relativement rare chez les plantes. Par conséquent, d’autres recherches sur la polykétide synthase de type III (PKS III), la cyclase (PKS-Cyclase) et la kétoacylréductase (pks-kétoacyl-coa réductase, KR) peuvent révéler davantage le mécanisme de synthèse de l’acide ginkgolique, et la teneur en acides phénoliques dans les tissus ginkgo peut être contrôlée en combinant des méthodes physiques et chimiques ou biotechnologiques.
2.2 gènes d’enzymes clés pour la synthèse de l’acide phénolique
At present, the main reports on the research of key enzyme genes for phenolic acid synthesis come from urushiol, while there are few reports on ginkgolides....... La voie de synthèse de l’acide phénolique est divisée en 2 parties: la synthèse des acides gras et la synthèse des anneaux aromatiques. Parmi celles-ci, la protéine porteuse d’acyle (ACP), la stéaroyle désaturase (SAD), la KASs (KASs), la polykétide synthase de type III (PKS III) et la cyclase (PKS-Cyclase) sont des enzymes clés qui déterminent le taux et le rapport de contenu de la synthèse de l’urushiol.
2.2.1 protéine porteuse d’acyle (ACP)
La protéine porteuse d’acyle (ACP) appartient à la grande famille des protéines porteuses. En tant que protéine mélangée, elle peut s’associer à divers complexes protéine-enzyme pour transférer des chaînes d’acyle d’un Site internetde centre enzymatique à un autre. Il agit également comme cofacteur pour la stéaroyl-acp désaturase (SAD) et acyl-ACP hydrolase (AAH), et joue un rôle important dans les voies de la synthèse des acides gras (FAS) et de la synthèse des polyketide (PKS).
Li Mengjun et al. [43] [traduction] ont analysé la structure des gènes de la protéine porteuse de l’acyl chez 17 espèces, dont Arabidopsis thaliana, Clycine max, Oryza À propos de sativaet Zea mays, et les ont classées en cinq catégories. Parmi eux, la famille de gènes ACP de type plasmidique (la région codante se compose de 4 exons et 3 introns) et la famille de gènes ACP de type mitochondrial (la région codante se compose de 2 exons et 1 intron) représentent la plus grande proportion de l’ensemble. Ils ont tous deux un site serine très conservé qui peut se lier au 4' -phosphopantéthéine adduct cofactor group, et activer le holo-ACP pour fonctionner. La structure tertiaire de la famille des protéines ACP est généralement cohérente et se compose de quatre hélices α conservées. Trois des hélices α (I, II, IV) sont parallèles, tandis que l’hélice α (III) est perpendiculaire au centre de l’hélice, formant une cavité structurale hydrophobe fournissant une structure hydrophobe protectrice pour diverses chaînes d’acyle [44].
L’hélice α, que l’on appelle l’hélice de reconnaissance, peut interagir avec la synthase ketoacyl-ACP, que l’on appelle la synthase β-Ketoacyl-ACP, que l’on appelle l’hélice de reconnaissance. Singhal [38] a réalisé le séquençage des transcriptomes sur les geraniums et éliminé deux séquences complètes d’adnc de protéine ACP (Pxh1 et Pxh2) liées à la synthèse de l’acide urushiol. La vérification de l’expression génétique et l’analyse phylogénétique ont montré que les gènes Pxh1 et Pxh2 étaient fortement exprimés dans le tissu trichome du geranium, et sont très homologues au gène de biosynthèse de la protéine ACP de l’acide 14-carbone-1-ène (δ9 C14:1) de la coriandre (Coriandrum sativum), qui catalyse la désaturation des acides gras dans la voie de l’acide uronique.
2.2.2 Ketoacyl-ACP synthase (KASs)
Sous l’action du complexe des acides gras synthases (FAS), la malonyl-ACP est utilisée comme substrat pour former les précurseurs de l’acide ginkgolique, de l’acide palmitoléique (δ9 C16:1) et de l’acide oléique (δ11 C18:1), à travers de multiples cycles de condensation. Le complexe des acides gras synthases est composé de trois synthases kétoacyl-acp (KASs), qui appartiennent à la superfamille des enzymes cond. Ce sont toutes des lipoprotéines hydrophobes contenant le domaine structurel conservé par KAS et aucun peptide signal. KAS III catalyse la polymérisation de la malonyl-CoA et de l’acétyl-coa pour former la chaîne acyle initiale (3-kétobutyryl-acp); KAS I catalyse la polymérisation de la chaîne d’acyle et de malonyl-ACP pour former des acides gras avec 6C-16C; Et KAS II catalyse la condensation de malonyl-ACP et de l’acide palmitique pour former des acides gras 18C.
Chez des plantes telles que perilla [45] et le coton des hautes terres [46], KAS II est une protéine non sécrétée légèrement acide ayant une longueur d’acide aminé d’environ 500 aa. Il détermine le rapport des acides gras C16:C18 et peut réguler la résistance au froid des plantes. Les chercheurs ont obtenu sept gènes ketoacyl-ACP synthase (KASs) à partir du transcriptome de Pelargonium xanthium, dont PxKAS
2.2.3 stéaroyl-désaturase acp (SAD)
La désaturase de stéaroyl-acp (SAD) est la seule famille connue de désaturases solubles dans les plantes, qui régule le rapport entre les acides gras saturés et insaturés. Parmi eux, la dénaturase δ9 stéaroyl-acp est la plus largement étudiée dans les plantes. Il catalyse la déshydrogénation des positions C9 et C10 de la chaîne d’acyle pour former la première double liaison. La protéine SAD est un homodimère composé d’un domaine conservé appartenant à la famille des désaturases acyl-ACP et d’un domaine conservé appartenant à la famille des ferritines. Les quatre hélices α dans la région conservée triste forment une structure de faisceau de quatre hélices, qui cache un centre catalytique symétrique de faisceau de deux ferres de Fe-O-Fe. Ensemble, ils forment le centre actif de l’enzyme pour la déshydrogénation de la chaîne d’acyle [47]. La structure cristalline des protéines montre que l’enzyme SAD a une rainure profonde s’étendant de la surface moléculaire à l’intérieur, qui peut accueillir la chaîne d’acyle 18C et se lier au centre ferreux au fond de la rainure pour subir des réactions redox. Cette structure à rainure peut également permettre aux chaînes d’acyle 16C et 14C de réagir, mais le taux de renouvellement catalytique est faible [48].
Schultz et al. [41] ont projeté une nouvelle dénaturase acyl-ACP provenant d’une bibliothèque adnc de géranium. L’alignement des séquences génétiques a révélé un degré élevé d’homologie avec le gène de dénaturase (SAD) de stéaroyl-acp de la féverole de ricin. Les résultats de la transformation génétique et de la vérification à l’aide d’escherichia coli (E. coli) ont montré que le nouveau gène peut catalyser la déshydrogénation de l’acide myristique-acp (C14:0) pour former l’acide myristique-acp (δ9 C14:1), de sorte qu’il est appelé gène de désaturase de l’acide myristique-acp (MAD, δ9 14:0-ACP desaturase). La détection de l’expression génétique singhale [38] et la validation de la transformation génétique du tabac (Nicotiana tabacum) montrent que le tétradécyl-acp (δ9 C14:1), le produit catalysé par l’acide myristique - acp désaturase (MAD), est un précurseur clé de palmitoléique acp (δ11 C16:1) et oléique acp (δ13 C18:1). L’activité de la désaturase de myristoyl-ACP (MAD, δ9 14 2:0 - ACP désaturase) détermine la teneur en palmitoyl-ACP (δ11 C16 1:1) et en oléoyl-acp (δ13 C18 1:1) en détectant l’activité enzymatique, la teneur en acides gras et la teneur en acide phénolique, qui à leur fois régule la teneur des deux chaînes latérales monoényle, l’acide oléique (C22:1 et C24:1). De plus, le Singhal [38] a établi un gradient de température (18, 23 et 28 °C) pour étudier les changements d’expression de gènes enzymatiques associés dans le tissu trichome du geranium et a constaté que les niveaux d’expression du gène de déaturase de l’acide myristique (MAD, δ9 14 2:0 - Gène de dénaturase ACP) et de dénaturase stearoyl-ACP (SAD, δ9 18 La dénaturase 0-ACP) diminuait avec l’augmentation de la température.
Wang et al. [49] cloned a stearoyl-ACP desaturase gene (SAD, Δ9 18:0-ACP desaturase) from Ginkgo biloba leaf cDNA and subjected Ginkgo biloba leaves to temperature stress (4, 15 and 45 °C). The results showed that the gene expression was high at low temperatures (4 °C) and room temperature (15 °C), while the gene expression at high temperatures (45 ℃) was several times lower than that of the control group. Subsequently, Liu Xinliang et al. [50] [traduction] showed that the GbSAD gene encodes a peptide chain with a chain length of 412 aa and a molecular weight of 47 kDa. Cluster analysis showed a high degree of similarity with the stearoyl-ACP desaturase (SAD) amino acid sequences of other gymnosperms. Exogenous hormone experiments showed that the expression of the GbSAD gene was not réglementéby abscisic acid (ABA), methyl jasmonate (MeJA) or ethylene (ETH), but salicylic acid (SA) activated gene expression, with the highest expression value being 9.7 times that of the control group, indicating that SA may be impliquésin the regulation of the fatty acid synthesis pathway.
Pelargonium graveolens et Ginkgo biloba contiennent respectivement la dénaturase unique de l’acide myristique acp (MAD, δ9 14 2:0-acp desaturase) et de l’acide stéarique acp desaturase (GbSAD, δ9 18 2:0-acp desaturase). Les deux enzymes sont sensibles à la température et très actives à basse température. Les deux enzymes sont les seules désaturases solubles dans l’eau des plantes et présentent un degré élevé de similarité en termes de structure fonctionnelle. Par conséquent, la vérification de la fonction homologue de la stéaroyl-acp desaturase de ginkgo (GbSAD, δ9 18:0-ACP desaturase) permettra de clarifier davantage le mécanisme de synthèse de l’acide ginkgolide.
2.2.4 polykétide synthase de Type III (PKS III)
Les synthases polycétide sont divisées en trois catégories: ①PKS I, connu sous le nom de PKS modulaire, est composé de plusieurs polypeptides multifonctionnels, dont chacun porte un domaine catalytique unique et non réutilisable. PKS II, également connu sous le nom de PKS itératif ou aromatique, est un système itératif d’un complexe multi-enzymatique qui utilise un ensemble de domaines réutilisables pour catalyser la formation de structures de polycétone de phénol plusieurs fois au cours des étapes de réaction répétées. ③PKS III, connu sous le nom d’enzyme de type chalcone synthase, est complètement différent des deux premiers types de familles d’enzymes PKS. Il peut réutiliser des protéines bifonctionnelles homologues, ne repose pas sur l’activation de l’acp et de son site actif 4&#Il n’est pas nécessaire d’activer le substrat acyl-CoA par l’intermédiaire de l’acp pour réagir directement avec l’acyl-coa. Bien que les mécanismes structuraux des différents types de KS soient différents, ils utilisent tous le domaine kétosynthase (KS) ou sous-unité pour catalyser la formation de liaisons C-C, qui décarboxylate et condense acyl-CoA pour prolonger la chaîne du carbone.
La famille PKS III est très diversifiée. Chalcone synthase (CHS) et stilbène synthase (STS) sont les deux premières familles découvertes et les plus représentatives. Leurs séquences d’acides aminés sont de 60% à 75% semblables [42]. La famille des chalcone synthase (CHS) est largement présente dans les plantes. Il s’agit d’une protéine homodimère d’un poids moléculaire de 40-45 kDa. En utilisant un centre actif hautement conservé (une combinaison de Cys-His-Asn), il catalyse l’allongement de la chaîne de carbone de coumarine CoA en utilisant trois substrats de pyruvate-CoA pour former une structure d’anneau intermédiaire de tétrapeptide [42, 51-52]. L’ion hydrogène C6 de l’anneau intermédiaire du tétrapeptide subit une réaction de condensation de Claisen avec le groupe cétone C1 pour former un anneau à cycle hexachlorocarbone, qui est ensuite aromatisé pour former une diphénylcétone, également appelée chalcon (Figure 5). Chalcone est un précurseur important pour la synthèse des flavonoïdes. L’enzyme stilbène synthase (STS) a été rapportée chez des plantes et des microorganismes (par exemple Streptomyces, levures et bactéries). Il a un poids moléculaire d’environ 43 kDa, est un dimère composé de 2 sous-unités, et possède une protéine avec un domaine spécifique conservé IPNS(F) AGAIAGN, qui est très homologue à la chalcone synthase (CHS) [53] [traduction].
L’enzyme STS utilise le coumaroyl CoA comme substrat pour former une structure d’anneau intermédiaire de tétrapeptide. Le groupe C7 cétone de l’anneau intermédiaire tétrapeptide subit une réaction de condensation Aldol avec l’ion hydrogène C2 pour former un anneau de carbone à six membres, puis aromatisé pour former le glycoside phytoalexin resvératrol [54] (Figure 5). Singhal [38] a trouvé une kétoacyl CoA synthase de type 2 (KCS2, Keto-acyl CoA synthase 2) dans le geranium (Pelargonium hortorum), sa structure spatiale tertiaire est similaire à celle de polyketide synthase de type III (PKS III), Et il est supposé être impliqué dans la réaction de condensation de cyclization dans la voie de synthèse de l’urushiol. Ktoacyl CoA synthase (KCS) est une enzyme limitant le taux qui catalyse la première réaction de condensation dans la synthèse d’acides gras à très longue chaîne (VLCFAs). La recherche sur sa famille de gènes s’est principalement concentrée sur la plante modèle Arabidopsis thaliana, et il existe peu de rapports de recherche sur d’autres plantes. Costaglioli et al. [55] ont classé les 21 membres du gène KCS chez Arabidopsis en quatre sous-groupes (FAE1, KCS1, FDH Het CER6) en fonction de l’homologie génétique et de l’analyse de l’évolution génétique. Parmi eux, le gène FAE1 a été le premier gène de la famille KCS cloné par James et al. [56] à l’aide de la méthode de marquage par transposon. La séquence d’acides aminés de FAE1 est très homologue à d’autres synthases polykétide (chalcone synthase (CHS), squalene synthase (STS) et kétoacyl-acp synthase de type III (KAS III)).
La ktol-acyl CoA synthase (KCS) de différentes espèces a des spécificités de substrat différentes. Ginkgolide A appartient à la Laque substances acides Et sa synthase polykétide de type III spécifique à la voie (PKS III) est similaire en termes de sa structure fonctionnelle à géranium&#En outre, la polykétide synthase de la voie de l’acide urushiol et l’acyltransférase (STS) reconnaissent toutes deux que le groupe C7 cétone dans l’anneau intermédiaire tétrapeptide et l’ion hydrogène C2 subit une réaction de condensation aldol pour former un anneau à cycle hexa de carbone. La différence est que l’acyltransférase (STS) subit une réaction de décarboxylation lors de la réaction de cyclisation de condensation aldol, qui oxyde le groupe cétone en position C1 pour libérer du dioxyde de carbone. Cependant, lors de la cyclisation polycétide de l’acide lactonique, le groupe cétone C1 est retenu, et la structure de l’acide benzoïque est formée par le remplacement de CoA par un ion hydrogène (H+). Le mécanisme catalytique actuel n’est pas encore clair et nécessite des recherches supplémentaires.
2.2.5 polykétide cyclase (PKS-cyclase)
L’acide 2,4-dihydroxy-6-pentylbenzoïque (acide olivétique), également connu sous le nom d’acide olivétique, est un précurseur important pour la synthèse des cannabinoïdes. Gagné et al. [57] ont constaté que l’hexanoyl-coa est catalysé par le PKS III (TKS) du cannabis pour synthétiser une structure d’anneau intermédiaire de tétrapeptide contenant 12 carbones. Si l’enzyme TKS continue à catalyser, la chaîne acyle est condensée et cyclisée aux positions C2 et C7, libérant du CO2 pour former le 3,5-dihydroxy-pentylbenzène (Olivetol); Tandis que la réaction de condensation et de cyclization catalysée par le PKS cyclase (acide olivétique cy- classe, OAC) catalyse une réaction de condensation qui retient le groupe carboxyle C1 pour produire de l’acide 2,4-dihydroxy-6-pentylbenzoïque (acide olivétique). L’analyse de la fonction protéique montre que l’enzyme OAC contient une topologie unique de β-α-β-β-α-α-β et peut catalyser la cyclisation du groupe acyle aux positions C2 et C7 et retenir le groupe carboxyle.
OAC est une nouvelle protéine fonctionnelle contenant un domaine dimerique α+β barrel (dimeric α+β barrel protein, DABB), qui se trouve principalement dans les bactéries, les champignons et les plantes. À l’exception de l’acide cannabidiolique cyclase CsOAC de Le Cannabissativa, les protéines de type barb des plantes sont principalement de la famille des protéines stables à la chaleur (HS) et sont très semblables en structure aux polykétide cyclases des espèces de Streptomyces [58] [traduction]. La protéine DABB est une petite protéine (12 kDa, 101 aa) qui est localisée dans le cytoplasme avec le PKS III, joue un rôle de chaperone en guidant le pliage du produit intermédiaire tétrapeptide, et forme finalement une substance contenant une structure d’acide benzoïque. Les recherches de gagné et al. [51] ont retenu le groupe cétone C1 pour la cyclization polykétide de la synthèse de l’acide laconique, fournissant de nouvelles références et idées pour le processus catalytique de formation d’acide benzoïque.
3 perspectives
Dans les années 1960, les ginkgolides ont été identifiés comme l’une des substances actives de l’enveloppe extérieure des graines de ginkgo. Avec la vulgarisation de la technologie de chromatographie liquide et spectrométrie de masse à haute performance (HPLC-MS/MS) et l’amélioration de la précision de détection de la RMN (technologie de résonance magnétique nucléaire), il est maintenant possible d’isoler et d’identifier les cinq acides de ginkgo communs et quatre ginkgolides à partir de tissus tels que les feuilles et les fruits de ginkgo. Les Ginkgolides sont des laques et ont des propriétés polaires uniques (hydrophobes et hydrophiles), qui ont conduit à leur utilisation dans de nombreux domaines tels que la médecine, la chimie, la beauté et la lutte antiparasitaire. En particulier, Fukuda et al. [59] ont montré que l’acide ginkgolique (C15:1) empêchait l’acylation de petites protéines modificatrices liées à l’ubiquitine (SUMO) pour réguler les fonctions cellulaires connexes. Il est considéré comme un médicament potentiel pour le traitement du cancer et des maladies neurologiques et est digne de la recherche et du développement.
Outre le ginkgo, des acides d’urushiol ont également été isolés et identifiés dans des cultures commerciales telles que l’anacardier (C. equatorialis), le sumac, les pistaches et les géraniums. Schultz et al. [60] ont mené des expériences sur la synthèse de l’acide urushiol. Les résultats ont montré que l’acide citrique marqué au 14c, le propionyl-CoA, l’oléoyl-coa, l’acide acétique, l’acide myristique et l’acide palmitique étaient incubés avec des cellules trichomes de Pelargonium graveolens. Seul l’oléoyl-coa (C18:1) s’est révélé impliqué dans la synthèse de L’urushiol est une source efficace de carbone, tandis que les autres substances ont tendance à synthétiser le triacylglycérol pour former des lipides de stockage. Par conséquent, le palmitoléoyl-coa (C16:1) et l’oléoyl-coa (C18:1) ont été identifiés comme des précurseurs importants pour l’étude de la synthèse de l’acide lacosane. Cependant, le ginkgolide, en tant que phytoalexine unique au ginkgo, a une voie de synthèse et de régulation moléculaires spéciales et conservées. À l’heure actuelle, la recherche sur la régulation de la synthèse du ginkgolide se concentre principalement sur le transcriptome lipidique et l’analyse métabolomique, alors qu’il existe peu de rapports sur l’exploration du mécanisme de synthèse du polykétide et le clonage de gènes apparentés, des recherches plus poussées sont donc nécessaires.
Les facteurs de transcription MYB et WRKY peuvent réguler l’expression des membres de la famille des polycétide synthase de type III (PKS III), affectant les changements dans le contenu des métabolites secondaires avec des effets de résistance. L’enzyme limitant le taux clé dans la synthèse des acides de laque est une synthase polykétide de type III (PKS III) qui est très homologue à ktoacyl CoA synthase (KCS). Eckermann et al. [61] ont découvert que l’herbicide métazachlore peut inactiver l’enzyme limitant le taux (ktolacton CoA synthase (KCS)) dans la synthèse des acides gras à très longue chaîne (vlfa) ainsi que la chalcone synthase (CHS) et la squalène synthase (STS) de la famille des polykétide synthase III. Le chloroacétamide métazachlore peut se lier à la cystéine au site clé de l’enzyme en question, empêchant ainsi la réaction de condensation de se dérouler normalement. À l’avenir, la substance chimique sera vérifiée à l’aide d’une lignée cellulaire de suspension de ginkgo afin de déterminer si elle peut également inactiver la polykétide synthase de type III (PKS III) qui synthétise l’acide laconique. Cela permettra de mieux comprendre la fonction catalytique et le mécanisme de régulation de la polykétide synthase de type III (PKS III) dans la synthèse de l’acide laconique. L’élucidation progressive de ces mécanismes de régulation fournira des conseils théoriques et pratiques pour la culture de lignées cellulaires à faibles ou à hauts rendements en acides phénoliques.
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