Qu’est-ce que la papaïne et ses utilisations dans l’industrie des aliments pour animaux?

La papaïne enzymes are primarily found in Le conseil des ministresroots, stems, leaves, Et en plusfruits De lapapaya, with the highest concentrations in the latexDe launripe fruits (Ye Qiteng Et etal., 1999; Zhao Yuanfan Et etal., 1999; Yi Yin et al., 2000). Due to their strong protein-degrading ability and the ability to hydrolyze amide bonds and ester bonds, papain enzymes are widely used in the pharmaceutical, food, textile, leather, feed, and dye industries (Wu Xianrong et al., 1988).

1 aperçu des Enzymes de la papaïne

Papaïne dérivé de papayeLe jus n’est pas une enzyme pure. Ces enzymes brutes contiennent non seulement de la papaïne, mais aussi du lysozyme, de la cystéine protéase, de la cellulase, de la glucanase, de la glutamine et des composés thiol de faible poids moléculaire. Sur la base de leurs points isoélectriques, les enzymes contenant du cystène dans le latex de papaye peuvent être classées en trois grandes catégories: la papaïne, le complexe de la papaïne (chymopapaïne), et le lysozyme. Papaïne a un pI Ide 9,55, chymopapaïne a un pI de 10,10, et lysozyme a un pI > 11.0. Dans des conditions quasi neutres, ces trois enzymes peuvent être facilement séparées par chromatographie sur colonne d’échange cationique. Dans le latex de papaye, la papaïne représente environ 10% des protéines solubles, la chymopapaïne, 45%, et le lysozyme, 20% (Ling Xinghan et al., 1998).

2 La Structurede la papaïne

2.1 papaïne

La papaïne a été la première enzyme à être découverte, étudiée et largement appliquée. En 1937, Balls et Lineweaver ont extrait la papaïne cristalline du jus de papaye frais en utilisant une méthode de précipitation de sel graduée. En 1970, la séquence de la papaïne a été déterminée, et en 1971, sa La structuretertiaire a été déterminée par cristallographie aux rayons x.

La papaïne a une masse moléculaire relative de 21 000 et se compose d’une chaîne polypeptidique unique composée de 212 résidus d’acides aminés. En 1969, Husain et Towe ont rapporté la séquence d’acides aminés de cette enzyme (voir Figure 1).

La papaïne contient sept résidus de cystéine, dont six forment des liaisons disulfées à l’intérieur de trois chaînes, tandis que le résidu libre restant de cystéine est un des résidus de cystéine.Acide aminé essentielRésidus du centre actif. Drenth et Al., et al.ont déterminé la structure tertiaire de la molécule de papaïne, qui est elliptique et se compose de deux domaines, avec une gorge étroite à la jonction, où se trouve le site actif de l’enzyme (Chen Zizhen, 1978).

2.2 papaïne caillée

La papaïne a été découverte, extraite et nommée pour la première fois par Jansen et Balls en 1941 (Jansen et al., 1941). La composition de la papaïne est relativement complexe. En 1967, Le Kunimitsuet al. ont séparé la papaïne à l’aide de colonnes échangeuses d’ions et l’ont classée en deux types selon l’ordre d’élution: la papaïne A Aet B; En 1982, Brocklehurst et al. ont signalé que la papaïne se compose de quatre composants. En 1985, ils ont utilisé une élution par gradient NaCl extrêmement lente pour obtenir cinq pics actifs (Kunimitsu et al., 1985; Brocklehurst et al., 1987).

Silvia et al. (1989) ont effectué une analyse du dichroisme circulaire sur les quatre sous-types de papaïne. Actuellement, on a découvert que la papaïne existe en différents sous-types, avec seulement une ou deux différences d’acides aminés entre eux (boutonnéeet al., 1984). Selon les données de bases de données telles que EMBL/GenBank/DDJB, il existe au moins neuf sous-types, chacun codé par des gènes différents. Parmi ceux-ci, six sous-types sont constitués de chaînes polypeptidiques avec 218 acides aminés, deux avec 227 acides aminés et un avec 226acides aminés. Les séquences d’acides aminés des neuf sous-types sont représentées à la Figure 2. Les résultats de la comparaison indiquent que parmi ces 9 sous-types, seuls les sous-types II, III et V présentent des résidus d’acides aminés individuels à des sites spécifiques qui diffèrent de ceux d’autres sous-types.

Maes et al. (1996) et Azarkan et al. (1996) ont déterminé la structure tridimensionnelle de la papaïne (voir Figure 3). Comme le montre la Figure 3, le pliage polypeptidique de la papaïne forme deux domaines de taille égale mais de formes différentes: le domaine L et le domaine R. Le domaine L est principalement composé de α-hélices, tandis que le domaine R est principalement composé de β-feuilles anti-parallèles. Le site actif est situé à l’interface entre ces deux domaines. La papaïne appartient à la classe α+β, où le domaine C-terminal de la papaïne est une structure entièrement α-hélicoïdal, tandis que le domaine N-terminal est une structure entièrement β-feuille (Schulz et al., 1979). En revanche, la papaïne appartient à la classe α/β, avec sa structure secondaire contenant plus d’hélices α et de feuilles β, et les modèles de pliage des structures secondaires sont également différents (Ssolis-Mendiola et al., 1992).

La papaine contient huit résidus de cystéine, dont six forment des liaisons disulfure intra-moléculaires, tandis que les deux autres groupes libres actifs de sulfhydryle se trouvent aux résidus 25 et 117. En raison de leur distance importante et de leurs régions différentes, ces deux résidus ne peuvent pas former de liaisons disulfure intra-moléculaires. Les deux résidus ont une activité similaire. Du modèle tridimensionnel de la papaine, Cys117 est situé sur la surface moléculaire, le rendant facilement accessible aux réactifs de dérivation et susceptible à une oxydation complète et irréversible. Le Cys25 catalytique, ainsi que le Cys22 et le Cys56 conservés, forment le microsite S1. En raison de la «poche» relativement grande du micro-site S1, il n’a presque aucun effet sur l’enzyme et#39; S spécificité du substrat. Cependant, le micro-site S2, composé de résidus aux positions 67, 68, 69, 133, 157 et 207, influence l’enzyme.#39; spécificité du substrat S (Maes et al., 1996).

2.3 lysozyme de papaye

En 1955, Smith et al. ont isoléPapaïne cristalline pureEn latex de papaye. Plus tard, Haward et Glazer ont déterminé la structure et les propriétés de cette enzyme. La papaïne a un poids moléculaire de 24 000, ce qui est supérieur à celui du lysozyme animal. Il se compose de 223 acides aminés, avec la composition en acides aminés indiquée dans le tableau 1. Par rapport au lysozyme animal, la papaïne a des niveaux significativement plus élevés de proline, de tyrosine et de phénylalanine.

La disposition des acides aminés à l’extrémité N-terminal est la suivante: glycine-isoleucine-serine-isoleucine. La disposition des acides aminés à l’extrémité C-terminal est la suivante: serine-phénylalanine-glycine. La structure supérieure de la papaïne a été déterminée par spectroscopie à dichroisme circulaire, avec des hélices simples représentant environ 30% du total. Les mesures spectroscopiques et les réactions chimiques des réactifs indiquent que les résidus de tryptophane sont entièrement incorporés dans la molécule enzymatique et ne participent pas à la liaison de la n-acétylglucosamine ou aux réactions actives. Le lysozyme de papaïne contient 8 résidus de cystéine, dont 4 forment des liaisons disulfées et 4 sont des groupes SH libres. Un groupe SH est essentiel pour l’enzyme#39; S site actif. La structure du site actif du lysozyme de papaïne est significativement différente de celle du blanc d’œuf et du lysozyme humain (Funatsu et al., 1982).

3 propriétés de la papaïne

3.1 propriétés de la papaïne et de la protéase de la papaïne

La similarité structurelle des papaïnes protéases détermine leur similarité significative dans les propriétés. La papaïne et la papaïne protéase présentent toutes deux une grande spécificité du substrat, la plupart des liaisons peptidiques peuvent être hydrolysées dans une certaine mesure par la papaïne, mais les taux d’hydrolyse varient considérablement entre les différentes liaisons peptidiques, certaines différant de trois ordres de grandeur; De nombreux dérivés d’acides aminés et peptides peuvent servir de substrats, parmi lesquels les dérivés d’arginine sont particulièrement sensibles à l’hydrolyse. Cependant, la papaïne fende diverses liaisons beaucoup plus rapidement que la papaïne.

Jansen et al. (1941) ont rapporté que la papaïne caséine protéase hydrolyse la caséine à seulement la moitié du taux de papaïne. Ebara et Yasunobue ont utilisé de la papaïne caséine protéase pour hydrolyser la chaîne β de l’insuline oxydée (oxydée avec du permanganate de potassium), mettant en évidence l’enzyme#39; S d’hydrolyser des liaisons peptidiques contenant des résidus d’acides aminés acides et des résidus d’acides aminés aromatiques. En étudiant les chaînes A et B de l’insuline et divers segments peptidiques de différentes longueurs contenant de l’acide glutamique, Layle A également noté l’avantage de la papaïne dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques contenant de l’acide glutamique. Il convient de noter que la papaïne présente une plus grande spécificité du substrat dans les milieux solvants organiques que dans les milieux aqueux (Jin-Eon So et al., 2000).

Papain and papain chymopapaïnecan also hydrolyze amide bonds and ester bonds (Ling Xinghan et al., 1998). They can catalyze the synthesis of oligopeptides but produce multiple byproducts, which may be due to the broad substrate specificity of the enzyme' site S S1 (Jin-Eon So et al., 2000).

Les valeurs optimales du pH de la papaïne et de la papaïne protéase varient selon le substrat. La papaïne protéase, utilisant la caséine comme substrat, a une température de réaction optimale de 80°C (pH 7,0) et une plage de pH optimale de 3-5 à 37°C. La valeur de la constante de Michaelis (Km) est de 1,25 g/l (à pH 7,0 et à une température de réaction de 37°C) (Zucker et al., 1985). La valeur optimale du pH de la papaïne est de 7,0, avec une stabilité du pH allant de 4 à 9. L’activité enzymatique reste stable en dessous de 60°C et conserve une certaine activité jusqu’à 90°C. En raison de sa grande stabilité thermique et de sa bonne stabilité, il convient au traitement des aliments.

Le PCMD,l’acide chlorobenzylique mercurique, l’acide acétique à l’iodure, l’acide acétique à l’iodure, le peroxyde d’hydrogène, le NEM et les métaux lourds tels que Hg² î, Ag î, Cu² î et Zn² î peuvent inhiber de façon irréversible l’activité enzymatique. La papaïne, contenant deux groupes libres de sulfhydryle, est plus sensible à l’oxydation par des agents oxydants ou par liaison avec des ions de métaux lourds, conduisant à l’inactivation. Toutefois, en présence de divers réducteurs (cystéine, acide thioglycolique,Le glutathion, DTT, T,etc.) et certains chélateurs métalliques (EDTA), ils peuvent réduire les résidus de cystéine dans le centre actif, activant ainsi l’activité enzymatique (Deng Jing etal., 2004).

3.2 propriétés du lysozyme de papaïne

Le Lysozyme est une enzyme qui peut fendre la liaison β-1,4 entre la n-acétylglucosamine et la n-acétylglucosamine. Papaïne lysozyme est une protéine alcaline avec un point isoélectrique de 10,5, présentant seulement un tiers de l’activité du lysozyme blanc d’oeuf contre Listeria monocytogenes, avec un pH optimal de 4,5 et une force ionique optimale de 0,04 à 0,07. Lors de la décomposition des parois cellulaires, il se comporte de la même manière que le lysozyme d’origine animale, il génère de l’acide n-acétylmuramique à l’extrémité réductrice. La papaïne présente une activité élevée dans la décomposition de la chitine. Par exemple, son activité dans la décomposition de la chitine gélatineuse est 10 fois supérieure à celle du lysozyme de blanc d’œuf, et son activité dans la décomposition (n-acétylglucosamine) (en français) est 200 fois supérieure à celle du lysozyme de blanc d’œuf. Les produits de la enzyme' S dégradation de la (n-acétylglucosamine) sont (n-acétylglucosamine)₃ et (n-acétylglucosamine)₂. La n-acétylglucosamine n’existe pas à l’état libre et les réactions de transfert de sucre sont rarement observées (So et al., 2000).

4 détermination de l’activité enzymatique

4.1 détermination de l’activité de la papaïne

L’activité de la papaïne est déterminée par la mesure de l’enzyme et#39; S capacité de catalyser l’hydrolyse des protéines de substrat dans des conditions spécifiées (telles qu’une certaine température et une certaine valeur de pH), la quantité d’acides aminés produite par l’hydrolyse des protéines servant d’unité de l’activité enzymatique. Plus la quantité d’acides aminés produite dans les mêmes conditions est élevée, plus l’enzyme est importante.#39; S la capacité de réaction catalytique et plus l’activité enzymatique est élevée.

Il existe trois méthodes pour déterminer l’activité de la papaïne: la méthode spectrophotométrique UV utilisant la caséine comme substrat, la méthode colorimétrique indophénol, et la méthode BAEE (benzoyl-L-arginine ethyl ester). Chaque méthode a ses propres caractéristiques. Le conseil des ministresMéthode spectrophotométrique UVL’utilisation de la caséine comme substrat est simple à utiliser, peu coûteuse et appropriée pour comparer l’activité enzymatique pendant la purification enzymatique, ainsi que pour déterminer l’activité des produits de papaïne et des enzymes alimentaires. Bien que la méthode colorimétrique à l’indophénol soit encombrante à exécuter, elle nécessite un équipement simple, ce qui la rend utilisable dans des zones aux ressources limitées; La méthode BAEE est stable et reproductible, ce qui la rend appropriée pour les études théoriques des propriétés enzymatiques et la détermination de l’activité enzymatique dans les enzymes réactifs (Wu Xianrong, 2005). La méthode spécifiée dans la pharmacopée des États-Unis et les normes pharmaceutiques chinoises pour déterminer l’activité de la papaïne est la méthode spectrophotométrique ultraviolette utilisant la caséine comme substrat (Luo Yanshou, 2000; Chen Deming et al., 2004).

Lors de l’utilisation de la méthode spectrophotométrique UV pour détecter l’activité enzymatique, l’unité d’activité est définie comme suit: dans les conditions d’essai, la quantité d’enzyme nécessaire pour émettre la quantité de substance soluble en acide trichloroacétique de la caséine hydrolysée par minute, lorsque l’absorbance à une longueur d’onde de 275 nm est équivalente à l’absorbance de 1 μg/ml de tyrosine, est une unité d’activité enzymatique.

L’utilisation de cette méthode nécessite une attention particulière: ① différentes concentrations d’acide trichloroacétique donnent des résultats différents d’activité enzymatique. ② la caséine d’origines différentes présente des différences significatives dans l’activité de la papaïne; La caséine importée a une meilleure solubilité et une activité enzymatique plus élevée. ③ la détermination doit être effectuée dans des conditions optimales de pH (Zhao Yuanfan et al., 1999).

4.2 détermination de l’activité de la protéase coagulante de la papaïne

Le procédé de détermination de l’activité hydrolytique de la protéase coagulante de la papaïne utilise une méthode spectrophotométrique UV avec la caséine comme substrat. Cette enzyme possède également une activité coagulante par rapport à la papaïne, l’unité d’activité de coagulation est définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour coaguler 1 ml de lait écrémé à 10% (contenant 0,01 mol/l CaCl₂) en 40 minutes, qui est définie comme une unité d’activité enzymatique, c’est-à-dire une unité de Soxhlet (SU). L’activité relative (RU) est utilisée pour indiquer l’influence de divers facteurs (Arima et al., 1967).

4,3 et 4,3  Détermination de l’activité de la papaïne lysozyme

Il existe généralement trois méthodes pour déterminer l’activité du lysozyme.

① en utilisant la paroi cellulaire comme substrat, l’activité enzymatique est indiquée par le changement de turbidité avant et après l’action.

② en utilisant le milieu de culture de Listeria monocytogenes comme substrat, l’activité enzymatique est indiquée par le changement de turbidité avant et après l’action.

Comme les deux méthodes ci-dessus impliquent des réactions de phase solide-liquide, il est difficile de mesurer avec précision les vitesses de réaction. Par conséquent, certains chercheurs ont préparé un substrat homogène en utilisantPolysaccharide soluble dans l’eauHexane diol chitine pour déterminer l’activité enzymatique.

③ méthode spectrophotométrique: à 450 nm, dissoudre une certaine quantité de poudre bactérienne lyophoséchée ou de suspension de bactéries solubuliques décongelées dans un certain volume de solution tamponnée de phosphates pour obtenir une valeur d’absorbance d’environ 1,3. Cette solution de substrat et la solution enzymatique standard sont incubées à 25°C dans un bain-marie. Placer 2,5 ml de substrat dans une cuvette de 1 cm dans le bain-eau, ajouter 0,5 ml de solution enzymatique, commencer le moment, enregistrer la lecture E1 à 1 minute et la lecture E2 à 2 minutes et calculer l’activité enzymatique à l’aide de la formule. Différentes solutions enzymatiques standard ayant des activités enzymatiques différentes correspondent à différentes valeurs de δe, et l’activité enzymatique de l’enzyme standard utilisée peut être calculée en fonction de ces valeurs de δe, ce qui permet de vérifier l’exactitude de la détection (Zhang Yong, 2004).

5 immobilisation de la papaïne

Les enzymes immobilisées sont une nouvelle technologie développée dans les années 1960. L’immobilisation désigne le processus de combinaison de cellules libres ou d’enzymes avec un support solide insoluble en utilisant des méthodes physiques ou chimiques pour maintenir leur activité et permettre une utilisation répétée. Pour améliorer l’efficacité d’utilisation de la papaïne et réduire les coûts de production, des chercheurs du monde entier ont mené des études approfondes sur l’immobilisation et l’application de la papaïne.

En 1961, J. : J. : J. :: J. : J. :Cebray a immobilisé avec succès la papaïne sur un porteur de polyacides aminés et l’a utilisée pour hydrolyser des fragments de γ-globuline. En 1977, J.W. Finley des etats-unis a employé une méthode de réliaison du glutaraldéhyde pour immobiliser la papaïne sur la chitine, et l’a utilisé dans le processus de production de la bière, obtenant de bons effets de clarification. En 1978, en France, P. Monsan et al. ont utilisé du verre microporeux aminoalkylé comme support pour rétiliser la papaïne sur sa surface et l’ont également appliqué à la clarification de la bière (Ling Xinghan et al., 1998).

Xu Fengcai et al. (1992) ont utilisé la cellulose de la bagasse de canne à sucre et le nylon comme supports pour immobiliser la papaïne, ont déterminé les propriétés enzymatiques de l’enzyme immobilisée et l’ont appliquée à la clarification de la bière. Li Hong et al. (2001) ont utilisé des microsphères de chitosan pour immobiliser la papaïne, ont étudié les propriétés enzymatiques de l’enzyme immobilisée et l’ont appliquée à l’hydrolyse de la caséine pour la production de tyrosine. Les auteurs ont également mené une série d’études dans ce domaine, y compris l’immobilisation de la papaïne à l’aide de fibres de soie provenant de vers à soie, ont étudié les propriétés enzymatiques de l’enzyme immobilisée et l’ont appliquée à l’hydrolyse de la caséine pour la production de tyrosine, ainsi qu’à la papaïne immobilisée à la soie dans un réacteur à lit de pacage et à son application, qui ont toutes donné des résultats satisfaisants (Chen Fangyan et al., 2004, 2005a, 2005b), et ont obtenu les produits correspondants de la papaïne immobilisée.

6  Application de papaïne dans l’industrie des aliments pour animaux

Pendant la transformation des aliments, de grandes quantités deSous-produits protéiquesSont générés, comme les plumes d’animaux, le sang d’animaux après l’abattage, les garnitures de poisson et les têtes de poisson provenant de la transformation du poisson. Ces protéines, lorsqu’elles sont directement broyées dans les aliments, sont difficiles à digérer et à absorber pour les animaux. Les rejeter non seulement gaspille des ressources, mais pollue également l’environnement. En utilisant des protéases pour hydrolyser ces protéines en protéines solubles de petites molécules et en acides aminés, elles deviennent facilement digestes et absorbables par les animaux. Cela permet non seulement de mettre au point des aliments à faible coût et de haute qualité pour les protéines, mais aussi d’améliorer l’efficacité de l’utilisation des aliments et de réduire les coûts des aliments (l Shimin et al., 2001; Tan Aijuan et coll., 1998; Yang Ping et al., 2008). Actuellement, les enzymes protéiques animales sont trop chères pour l’hydrolyse; Les méthodes de fermentation microbienne sont sujettes à la contamination par D’autres bactéries et peuvent contenir des toxines; Cependant, la papaïne a une forte activité, une stabilité thermique élevée et une bonne stabilité, ce qui la rend adaptée au traitement des aliments.

En outre, la papaïne, lorsqu’elle est ajoutée commeUn additif alimentaire pour l’alimentation du bétail, facilite la digestion des aliments, améliore l’efficacité des aliments, réduit la consommation d’aliments, améliore les taux de croissance du bétail et a des effets significatifs sur la production laitière, la qualité du lait et la prévention de la mammite chez les vaches laitières.

Zhang Qing et al. (1996) ont ajouté 0,3 % de papaïne à l’alimentation des crevettes et ont étudié les changements dans l’activité de la papaïne pendant la production et ses effets en aquaculture. Ils ont constaté que dans des conditions de production d’aliments pour crevettes (85°C, 45 minutes), la perte d’activité de la papaïne était grave. Cependant, dans des conditions de production d’aliments pour volailles (température de 75°C), l’activité protéase a été assez bien préservée. Par conséquent, dans des conditions de pelletisation, la température à laquelle la plus grande partie de l’activité enzymatique peut être préservée est d’environ 75°C. Dans l’élevage de crevettes, il a démontré un certain effet de promotion de la croissance, augmentant le rendement de 5%.

Binshiyu et al. (1996) ont ajouté 0,1% de papain au régime alimentaire des porcs en croissance, ce qui a amélioré le gain de poids quotidien et le taux de conversion alimentaire, l’effet le plus significatif étant observé chez les porcs de 10 à 20 kg (P et lt; 0,01). Les résultats indiquent que l’ajout de papaïne au régime alimentaire des porcs en croissance au cours de la phase de croissance précoce est le plus approprié, et elle peut également être utilisée en quantités modérées au cours de la phase de croissance moyenne.

He Ting et al. (1992) ont donné à des poussins de type carné un régime complété de papaïne (40 000 unités /kg d’aliments). Les résultats ont montré que bien qu’il n’y ait pas de différence significative dans la prise de poids moyenne entre les groupessupplemented with papain (P > 0.05), feed consumption was slightly lower in all experimental groups compared to the control group. Additionally, the use of FS protéinesfeed (fermented blood meal) in the diet was more effective than fish meal. Le conseil des ministresreason may be that FS protein feed contains not only animal blood but also various plant fiber-rich cake and meal carriers, which may allow other enzymes in papain to exert their effects.

7 Conclusion

Papaïne est un produit naturel pur avec de fortes capacités d’hydrolyse protéolytique et de synthèse, ainsi que la coagulation, la lipolyse et l’activité bactériolytique, ce qui le rend très polyvalent. Actuellement, le taux d’application mondial de papaïne est le suivant: 75% dans l’industrie de la brasserie et des boissons, 10% dans l’industrie de la transformation de la viande, 5% dans l’industrie de la transformation du poisson, 3% dans l’industrie pharmaceutique, 5% dans l’industrie de la transformation des aliments pour animaux, et 2% dans d’autres domaines. Il est évident que le taux d’application de la papaïne dans l’industrie des aliments pour animaux est relativement faible, ce qui indique un potentiel important de développement. Les raisons peuvent inclure: le coût relativement élevé de l’enzyme pendant le traitement des aliments, la perte importante d’activité enzymatique, qui limite son application; Ou, en tant qu’additif alimentaire, l’enzyme n’est pas utilisée scientifiquement pendant le processus d’alimentation. Par conséquent, comment améliorer et maintenir plus efficacement et durablement l’activité de la papaïne; Et comment utiliser correctement et raisonnablement cette enzyme chez différentes espèces animales et à différents stades de l’alimentation pour maximiser son efficacité sont des domaines clés qui méritent de futurs efforts de recherche et développement.

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