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japonaisQu’est-ce que le stéviol Glycoside Rebaudioside A?
Un apport élevé en sucre dans l’alimentatiSur lequotidienne est l’un des facteurs qui causent l’obésité. Les maladies cardiovasculaires causées par l’obésité, comme l’hypertension, l’hyperglycémie Et etle diabète, sont une crise majeure de santé publique qui affecte lA asanté humaine dans le monde entier [1]. Le Stevioside est un édulcorant zéro calorie extrait des feuilles de lA aplante de stevia, Et etest connu comme l’un des «world' S trois principales sources de sucre "avec le sucre de canne et le sucre de betterave [2]. Le stévioside présent dans les feuilles de la plante stévia est un mélange de molécules aux structures différentes, notamment le stévioside (St), le rébaudioside a (Reb a), le rébaudioside D (Reb D) et le rébaudioside M (Reb M)[3]. Reb A), rebaudioside D (Reb D), et rebaudioside M (Reb M), etc.[3]. La douceur du stevioside est 250 à 350 fois celle du saccharose, et il peut remplacer le saccharose en tant que nouvelle génération de source de sucre naturel sans calories [4].
Depuis les années 1990, les organismes de réglementation des aliments et des médicaments de nombreux pays d’europe et des États-Unis ont évalué l’innocuité du stévioside et approuvé à l’unanimité le stévioside de grande pureté (≥95%) comme édulcorant sécuritaire [5]. Ces dernières années, certains essais cliniques ont montré que le stévioside peut non seulement être utilisé comme édulcorant [6], mais a également une variété d’avantages pour la santé tels que l’anti-diabète, la baisse de la pression artérielle, cardiotonique, anti-inflammatoire, antibactérien, anti-tumeur et ainsi de suite [7].
Ces propriétés bénéfiques pour la santé ont donné au stevioside une demande plus large sur le marché. Les chercheurs ont actuellement mis au point une variété de nouvelles méthodes d’extraction et de synthèse du stévioside, qui ont grandement favorisé la production et l’applicationdu stévioside [8⁃10]. Cet article décrit la sécurité et la demande du marché du stévioside, résume l’application du stévioside dans les domaines des produits alimentaires et de santé, et fournit une perspective sur l’extraction végétale et la biosynthèse du stévioside, jetant une base théorique pour la recherche approfondie et la production industrielle du stévioside.
1. La sécurité du stevioside et la demande du marché
À la fdansdes années 80, laSécurité du steviosideA été largement remis en question, de sorte que les pays ont lancé des recherches sur la sécurité du stévioside. En 1995, la Food Et en plusDrug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé l’utilisation de stévia dans les compléments alimentaires [5]. En 2008, 2013et 2014, le Reb A, le Reb D et le Reb M ont été successivement reconnus comme généralement reconnus comme sûrs (GRAS) par la FDA [11⁃12]. Par la suite, l’innocuité des Les glycosidesde stéviol a également été reconnue successivement par le comité mixte FAO/ oms d’experts des additifs alimentaires (JECFA) [13], le Food Standards Australia New ZealEt en plus(FSANZ) [14], l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) [15], et l’autorité indienne de sécurité et de normes alimentaires (FSSAI) [16]. FSANZ) [14], l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) [15], et la Food Safety Et en plusStandards Authority De laIndia (FSSAI) [16]. En 2011, les départements concernés en Chine ont officiellement approuvé l’utilisation du stévioside comme additif alimentaire dans les boissons, les fruits en conserve, les condiments, les pâtisseries et autres aliments [3].
La Chine est le monde' S plus grEt en plusproducteur de Les glycosidesde stévia. Selon la China La stéviaAssociation, en 2009, China' la zone de culture de la stévia était d’environ 16 667 hectares, principalement répartis dans le Xinjiang, le Gansu, la Mongolie intérieure, le Hebei, le Jiangsu, l’anhui, le Heilongjiang et d’autres endroits, avec une production annuelle d’environ 40 000 tonnes de matières premières de stévia [17]. La production de Les glycosidesde stévia a été pleinement promue dans plus de 27 provinces et villes. Environ 80% du stevioside produit en Chine est exporté vers plus de 20 pays, dont le Japon, la Corée du Sud, les États-Unis et la malaisie. La Chine est actuellement le monde' S plus grEt en plusexportateur de stévioside [18]. En outre, des pays et des régions comme la russie, l’Inde, le Canada, l’afrique du sud et le Kenya ont également différentes zones de culture pour la promotion de la culture [19⁃21].
Actuellement, stevioside est devenu le monde et#39; S édulcorant naturel à haute intensité le plus largement utilisé, sans calories. Le Stevioside peut améliorer l’équilibre énergétique et aider au contrôle du poids. Selon les statistiques de l’international Stevioside Association, en 2016, environ 3 000 produits alimentaires et boissons contenant du Stevioside ont été lancés dans le monde, et le nombre de consommateurs a dépassé les 4 milliards [22]. En 2017, le nombre de produits alimentaires utilisant le stévioside comme additif édulcorant a dépassé le nombre de produits utilisant l’aspartame comme édulcorant. Et le nombre de personnes qui les consomment a dépassé les 4 milliards [22]. En 2017, le nombre de produits alimentaires utilisant les glycosides de stévia comme édulcorant a dépassé le nombre de produits utilisant l’aspartame comme édulcorant [23]. On estime que d’ici 2027, la consommation mondiale de poudre de stévioside atteindra 10 254,93 tonnes à un taux de croissance annuel de 7 à 8% [24].
Reb A est le stévioside le plus utilisé sur le marché. De janvier 2015 à février 2017, le prix du Reb A de grande pureté (≥95%) est passé de 73 000 USD/ tonne à 77 300 USD/ tonne [23]. En 2017, le marché mondial a atteint 417 millions de dollars américains. Avec les progrès de la technologie et le développement d’une nouvelle génération d’édulcorant naturel Reb M, on s’attend à ce que d’ici 2024, les ventes sur le marché de stevia augmentent à un taux annuel de 8,2 % pour atteindre 721 millions de dollars US [25]. Selon des études de marché pertinentes, le marché mondial du stévioside représentait 620,8 millions de dollars US en 2020, et devrait atteindre 1,14 milliard de dollars US d’ici 2028, avec un taux de croissance annuel composé (tca) de 8,0 %. [24], et le taux de croissance annuel composé pourrait atteindre 8,5% d’ici 2030, avec une taille de marché de 16,428 milliards de dollars[26].
2 applications de glycosides de stéviol
2.1 glycosides de stéviol comme édulcorants
Les glycosides de stéviol peuvent être utilisés dans les aliments en différentes proportions comme additif alimentaire [27] parce qu’ils conservent un bon goût lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec d’autres édulcorants. La sécurité des glycosides de stéviol étant reconnue, les glycosides de stéviol ont été largement utilisés sur le marché. Les formes courantes de glycosides de stéviol sont les poudres, les comprimés et les liquides, qui peuvent être utilisés comme édulcorants naturels dans les aliments tels que les boissons, la bière, les produits de boulangerie, la charcuterie, les conserves, les fruits et légumes transformés, les condiments, les aliments surgelés, les sauces, les collations et les céréales [6].
En 2013, Coca-Cola a commencé à produire des boissons contenant de la stévia, réduisant leur teneur en calories de 30% [28]. En 2018, Coca-Cola a lancé un stevia cola qui remplace complètement le sucre blanc par des glycosides de stévia, changeant le sentiment sucré et gras apporté par le sucre blanc et le remplaçant par une douceur douce et délicieuse. Tout en satisfaisant le besodansde douceur, il atteint également une glycation faible [29]. Le stévioside peut réduire la viscosité du substrat dans certains scénarios d’application, par exemple en modifiant la viscosité du vdansde fruits pour le rendre plus agréable au goût, ou en augmentant l’effet moussant de la bière pour rendre la mousse dense et durable [30].
L’utilisation de glycosides de stationnol au lieu du saccharose dans les produits de boulangerie peut réduire le taux de fermentation de la pâte et le volume du pain, et améliorer la valeur nutritive du pain en réduisant l’indice glycémique et le contenu énergétique [31]. Les biscuits à l’avoine préparés avec différentes proportions d’extrait de stévia pour remplacer le saccharose ont été évalués pour leurs propriétés sensorielles telles que l’apparence, le goût, l’odeur et la texture. Les résultats ont montré que les biscuits préparés avec 25% et 50% de saccharose remplacés par de l’extrait de stévia étaient les plus populaires auprès des consommateurs [27].
Dans la production de gelée et de confiture, l’addition de sucre affecte non seulement la douceur finale, mais contribue également à augmenter la quantité totale de solides solubles [32]. Le sucre en gelée ou confiture gels avec de l’eau ou un hydrogel. Lorsque les glycosides de stéviol sont utilisés pour remplacer complètement le saccharose, la gelée ne se fixe pas correctement et l’apparence en est affectée. Lorsque le sucralose, le stevioside et l’agar sont utilisés ensemble, la gelée se fixe à volonté et la teneur en calories de la gelée et de la confiture peut être réduite [33-34].
Les glycosides de stévia peuvent être utilisés pour remplacer le saccharose dans les bonbons sans sucre à base d’igname, de fruit du dragon, de papaye, de goyave et de kiwi, ainsi que dans les noix comme les noix, les arachides et les pignons. Tout en fournissant une nutrition minérale, ils satisfont également les consommateurs#39; Désir de douceur [35]. Remplacer le saccharose dans le chocolat par des glycosides de stationnol produit non seulement du chocolat sans sucre avec un goût similaire à l’original, satisfaisant les gens et#39; S la demande de goût, mais réduit également le risque de prise de poids possible et de maladies du métabolisme du sucre [36]. De plus, les glycosides de stéviol ne sont pas utilisés par les micro-organismes. Le remplacement du saccharose par des glycosides de stévol dans les cornichons et les légumes marinés peut contrôler la prolifération des micro-organismes et prévenir la détérioration pendant la fermentation[37].
2.2 fonctions de promotion de la santé des glycosides de stéviol
Le stévioside agit non seulement comme édulcorant, mais possède également une variété d’activités biologiques et d’avantages pour la santé, tels que des propriétés antidiabétiques, anticardiaques, anti-stéatose hépatique, anti-inflammatoires, antibactériennes et antitumorales [7]. Puisque le métabolite final des différents stéviosides est tout le stéviol, le stéviol ne s’accumule pas dans le corps, ce qui rend l’utilisation des stéviosides sécuritaire comme produits de santé sans causer d’effets secondaires toxiques [38].
Les glycosides de stéviol le stéviol, le glucoside de stéviol, le stvioside, le rebaudioside A, la stachydrine et le Reb A ont été utilisés pour l’alimentation de souris diabétiques de type 2 induites par la streptozotocine. Comparativement aux souris diabétiques de type 2 non traitées, les souris diabétiques de type 2 nouries avec des dérivés de stévioside présentaient une sécrétion d’insuline significativement accrue, un métabolisme du glucose accru dans le foie, une accélération du glycogène hépatique, une baisse de la concentration de glucose dans le sang et des taux d’hémoglobine glyquée (HbA1c) et une amélioration du diabète chez les souris [39].
Après six semaines d’alimentation de rats atteints de stéatose hépatique avec 75 à 150 mg/kg de St, le degré de stéatose hépatique dans le groupe expérimental de rats a été considérablement réduit, ce qui indique que le St peut faire baisser les lipides sanguins [40]. St a été utilisé pour nourrir des souris avec une colite ulcéreuse induite par le sulfate de dextran de sodium, des souris avec un choc létal induit par le lipopolysaccharide (LPS), et des rats avec une arthrite adjuvante induite par le Freund' S adjuvant complet (caf). Il a été constaté que le St peut inhiber la libération de facteurs pro-inflammatoires, améliorer la production de cytokines anti-inflammatoires et réduire considérablement les réponses inflammatoires [41]. (Freund' S adjuvant complet, adjuvant induit par FCA) arthrite adjuvant induit rats, il a été constaté que le St peut inhiber la libération de facteurs proinflammatoires, améliorer la production de cytokines anti-inflammatoires, et réduire de manière significative la réponse inflammatoire [41⁃43].
Le Stevioside a une efficacité évidente dans la fibrose anti-cardiaque, antibactérienne et antitumorale. Après une fibrose du myocarde induite par l’isoprotérénol chez la souris a été traitée par voie orale avec le st pendant 40 jours, le mice' les taux d’hydroxyproline du myocarde et l’indice de poids cardiaque ont diminué, et le degré de fibrose du myocarde a été considérablement réduit [44]. 20 mg/mL de st peut inhiber la croissance d’ Escherichiacoli. L’ajustement de la concentration de st peut inhiber la croissance de Bacillus subtilis, Aspergillus Niger, Rhizopus oryzae, etc. effet inhibiteur [45]. Le Reb A peut s’auto-assembler en micelles. La formulation de Reb A et honokiol (HK) en micelles auto-assemblées Reb A⁃HK peut améliorer la biodisponibilité orale de HK et améliorer son activité antitumorale. Par conséquent, le stévioside a un grEt en pluspotentiel dans l’administration de médicaments antitumoraux hydrophobes [46]. Les glycosides de stéviol peuvent également récupérer des espèces réactives d’oxygène telles que les radicaux hydroxyle et superoxyde, et peuvent être utilisés pour traiter des maladies telles que l’hypertension, le diabète de type 2, l’athérosclérose et les tumeurs.
3 méthodes de préparation des glycosides de stéviol
3. 1 extraction végétale des glycosides de stéviol
Méthodes traditionnelles pourExtraction des glycosides de stéviolLes plantes comprennent l’extraction à l’eau chaude, l’extraction au solvant, la macération et l’adsorption sur des résines macroporeuses [47⁃50]. Ces méthodes sont non seulement longues et laborieuses, mais aussi relativement inefficaces et consomment trop de solvants et d’énergie [51]. Avec le développement de la biotechnologie moderne, les chercheurs ont mis au point diverses méthodes pour extraire les glycosides de stéviol de la stévia naturelle.
L’extraction assistée par micro-ondes (MAE) peut utiliser l’énergie des micro-ondes pour favoriser le transfert du stévioside au solvant. Par rapport à la technique de macération traditionnelle, cette méthode a une température de fonctionnement optimale plus basse et le temps d’extraction optimal est réduit à 1/7 de la méthode de macération [49]. L’extraction par fluide supercritique est non seulement plus efficace que les techniques de macération traditionnelles, mais elle réduit également les émissions de dioxyde de carbone et la consommation de solvants [52].
L’extraction assistée par ultrasons (UAE) utilise principalement les vibrations ultrasonore pour rompre les cellules et libérer des substances intracellulaires. Comparativement à d’autres techniques d’extraction, cette méthode a une température d’extraction plus douce [53]. Le Reb A et le St extraits à l’aide de l’extraction dynamique solide-liquide rapide (RSLDE) sont des liquides incolores et transparents, tandis que le produit extrait à l’aide de la méthode traditionnelle de macération est jaune foncé. La méthode RSLDE augmente non seulement la production de stévioside, mais réduit également les étapes ultérieures de purification du produit, réduisant ainsi le coût de production du stévioside [54]. Les méthodes d’extraction ci-dessus sont encore au stade de la recherche en laboratoire et d’autres recherches sont nécessaires pour réduire le coût d’application industrielle [49, 53].
Les teneurs en stéviol et en rébaudioside A dans les feuilles de stévia sont les plus élevées, représentant respectivement 5 à 10% et 2 à 4% du poids sec des feuilles [55]. Par conséquent, les principaux composants des produits obtenus par les techniques d’extraction existantes sont le stéviol et le rebaudioside A. Reb D et Reb M sont présents dans les feuilles de stévia à des niveaux extrêmement faibles, ne représentant que 0,4%-0,5% du poids sec des feuilles, il est donc inefficace et coûteux d’extraire directement le Reb D et le Reb M de la stévia [9,56].
3. 2 biosynthèse du stévioside
L’extraction directe du stévioside des plantes est souvent influencée par la teneur en stévioside et le cycle de croissance des plantes. Ces dernières années, des chercheurs ont utilisé des techniques telles que le séquençage du génome et les étiquettes de séquence exprimée (ESTs) pour révéler les principales voies de synthèse des stéviosides dans la stévia naturelle [10,57], jetant les bases de la production hétérologue de stéviosides à l’aide de la biologie synthétique. Des études ont montré que la principale différence entre les différents types de glycosides de stéviol réside dans le nombre et la position des groupes de sucre, ce qui se traduit par une douceur et une sensation en bouche différentes [58]. Le trisaccharide St et le tétrasaccharide Reb A sont 250 à 300 fois plus sucrés que le saccharose, avec un léger arrière-goût [59]; Le pentasaccharide Reb D et l’hexasaccharide Reb M sont 350 fois plus sucrés que le saccharose, avec presque aucun arrière-goût et un meilleur goût [9].
La principale voie de synthèse du Reb D et du Reb M dans la stévia est la suivante: le stéviolest catalysé par les glycosyl transférases SrUGT85C2 et SrUGT74G1 pour transférer le groupe glucose du donneur de sucre uridinediphosphate de glucose (UDP-glucose) au groupe c13-hydroxyle du squelette-steviol par une liaison β-D-glucoside. Glucose (uridinediphosphate glucose, UDPG) aux groupes fonctionnels c13-hydroxyle et c19-carboxyle du squelette de stériol via une liaison β-D-glucoside pour former le rubusoside (Rub) [60]; Le groupe C13-glycosyl du rubusoside forme une liaison 1,2 -β-d-glycosidique sous la catalyse de la glycosyl transférase SrUGT91D2 pour former St[61]; Le groupe C13-glucosyl de St forme une liaison 1,3 -β-d-glycosidique sous la catalyse de la glycosyl transférase SrUGT76G1 catalyse la formation d’une liaison 1,3 -β-d-glycosidique pour générer Reb a [56]; Le groupe glucosyle en position C19 du cér A est successivement catalysé par SrUGT91D2 et SrUGT76G1 pour générer cér D et cér M (Figure 1) [61].
La biotransformation du stévioside est actuellement le moyen le plus rentable de réaliser une production industrielle de stévioside. La biotransformation du stévioside comprend principalement: (1) la construction d’une voie de synthèse du stévioside dans les micro-organismes en surexprimant les gènes de la glycosyltransférase pour synthétiser le stévioside de façon hétérologue en utilisant le glucose comme source de carbone; (2) synthèse du stévioside par biocatalyse.
3. 2. 1 La synthèse de novo du stevioside
Construire la voie de production de l’acide mévalonique (MVA) chez Escherichia coli, puis introduire un module terpène contenant les gènes de la diphosphate synthase de geranyle, de la cyclopentapropanoyl diphosphate synthase et de la kaurène synthase, un module de cytochrome P450 contenant les gènes de la diaglycolate oxydase, de la kaurène 13α-hydroxylase et du cytochrome P450 réductase, et de la 13α-hydroxylase et du cytochrome P450 réductase, ainsi qu’un module de glycosyltransférase composé des glycosyltransférases SrUGT85C2, Sr UGT91D2w, SrUGT74G1 et SrUGT76G1, la souche SSY10 pSY447 obtenue peut synthétiser 10,03 mg/L de Reb A à partir de zéro en 5 jours [61].
Une voie synthétique du steviol au Reb M A été construite avec succès chez Saccharomyces cerevisiae (Figure 1). Le mutant UGT76G1 Leu257Gly A produit quatre fois plus de Reb D que l’ugt76g1, et les mutants UGT76G1 Lys337Pro et UGT76G1Thr55Lys ont tous deux produit environ quatre fois plus de Reb M que l’ugt76g1. Était 4 fois celle de l’ugt76g1. Les mutants UGT76G1 Lys337Pro et UGT76G1Thr55Lys avaient une capacité accrue de produire du Reb M d’environ 20%, et la production de sous-produits tels que le Reb G et le Reb Q a été presque éliminée [9].
Par rapport aux méthodes traditionnelles d’extraction végétale et de synthèse chimique, la synthèse de novo de glycosides de stéviol conçus artificiellement peut produire des glycosides de stéviol spécifiques dans le parcours prévu, dans un délai plus court et dans le respect de l’environnement. Cependant, comme la synthèse de novo des glycosides de stéviol par des micro-organismes implique de nombreuses étapes de réaction catalytique, les niveaux d’expression des enzymes dans les micro-organismes pour certaines étapes clés sont faibles, et l’activité est faible, ce qui entraîne généralement de faibles rendements de glycosides de stéviol.
3. 2. 2 synthèse biocatalytique de stevioside
La synthèse biocatalytique du stévioside se réfère au processus d’utilisation d’enzymes ou de micro-organismes produisant des enzymes comme catalyseurs pour la synthèse du stévioside. La stéviaUGT76G1 peut catalyser la production de Reb A à partir de St[9]. La glycosyltransférase UGT76G1 est exprimée à la surface de Pichia pastoris GS115 en utilisant la protéine d’ancrage Gcw61p. La souche recombinante utilise le St comme substrat, le UDPG comme donneur de glycosyle, la catalyse de cellules entières pour générer le Reb a, le taux de conversion est d’environ 70,37% [62]. L’udpg est coûteuse, afin de réduire le coût de la catalyse, les chercheurs ont co-exprimé l’arabidopsis saccharose synthase AtSUS1 et le sorgho U GT76G1 a été co-exprimé en E. coli. La solution enzymatique brute d’atsus1 A catalysé la conversion du saccharose et de l’uridine diphosphate (UDP) en UDPG, et l’enzyme recombinant SrUGT76G1 A catalysé la synthèse du Reb A en utilisant le St comme substrat [58]. Cette méthode utilise l’udp bon marché et le saccharose comme substrats pour synthétiser l’udpg in situ, réduisant davantage le coût de production industrielle du stévioside (Figure 2) [11, 58].
La stéviarebaudianaUGT91D2 peut catalyser la production de Reb D à partir de Reb A [10]. Cependant, il n’y a actuellement aucune recherche sur l’enzyme recombinante SrUGT91D2. Les chercheurs ont exprimé la glycosyltransférase de tomate UGTSL2 dans E. coli, et l’enzyme recombinante A été en mesure de catalyser la production de Reb D et de Reb M2 à partir de Reb A comme substrat [63]. Le Reb M2 est un isomère du Reb M, et son innocuité n’a pas été vérifiée [16].
Une autre mutagénèse par saturation de l’ugtsl2 a donné lieu au mutant Asn358Phe, dont l’activité catalytique a augmenté de 21,9%, mais une petite quantité de Reb M2 était encore présente dans le produit [64]. 9%, mais une petite quantité de cér M2 était encore présente dans le produit [64]. La glycosyltransférase EUGT11 du riz (Oryza sativa) a été exprimée dans Escherichia Les coliet Pichia pastoris pour obtenir les souches recombinantes XE⁃3 et BL21 (pET28a~
L’eugt11 recombinant exprimé dans Pichia pastoris a une résistance aux acides et une stabilité thermique plus élevées que l’enzyme recombinant exprimé dans Escherichia coli [65]. Une stratégie de contrôle de la température en deux étapes élaborée à l’aide d’une conception orthogonale A été utilisée pour optimiser la production de Reb D chez la souche XE⁃3. La souche recombinante XE⁃3 a été cultivée dans un milieu BMMY contenant 0,75 % de méthanol et un milieu BMMY ~ pH 5 (milieu complexe méthanol tamponné) à 28 ° C pendant 3 à 4 jours pour obtenir une protéine cible d’environ 790 mg/L OsEUGT11. Par la suite, le Reb A et le donneur de sucre UDPG ont été ajoutés à la culture bactérienne, et les cellules entières de la souche recombinante XE⁃3 ont catalysé la production spécifique de Reb D à partir de Reb A à 35 °C pendant 4 jours, avec un rendement de 93,47 %.
Cette méthode simplifie les étapes de séparation et de purification des protéines (Fig. 3) [65]. Afin de découvrir de nouvelles glycosyltransférases à plus forte activité, les chercheurs ont combiné des méthodes de bioinformatique, telles que la comparaison de séquence d’homologie, l’analyse de domaine et la simulation de structure tertiaire, pour crier les glycosyltransférases CaUGT de Capsicum annuum et StUGT de Solanum tuberosum. Ils ont été exprimé en Escherichia coli, les deux enzymes recombinantes, CaUGT et StUGT, peuvent utiliser l’udpg comme donneur de sucre pour catalyser la conversion de cér a en cér D. cependant, le produit catalytique de l’enzyme recombinante CaUGT contient le sous-produit cér M2, tandis que l’enzyme recombinant StUGT peut catalyser spécifiquement la conversion de cér a en cér D avec un rendement de 97% [66].
À l’exception de la SrUGT76G1, aucune autre glycosyltransférase n’a été trouvée pour catalyser la conversion de Reb D en Reb M. La SrUGT76G1 recombinante exprimée en Escherichia coli peut catalyser la conversion de Reb D en Reb M avec un taux de conversion de 72,2% [67]. Le mutant SrUGT76G1T284S a augmenté la conversion du cér D en cér M d’environ 50% [68]. SrUGT76G1 exprimé en E. coli est enclin à former des corps d’inclusion, ce qui affecte la production efficace de glycosyltransférases [65]. Les chercheurs ont fusioné une étiquette peptidique acide courte au terminus c de SrUGT76G1 pour obtenir quatre enzymes de fusion acidique-queue, qui ont amélioré le niveau d’expression soluble, la stabilité thermique et l’activité catalytique de SrUGT76G1 chez E. coli. L’enzyme de fusion c-terminale acide présente 202,46% de l’activité du type sauvage lors de la catalyse de la production de Reb M en utilisant Reb D et UDPG comme substrats dans un tampon d’hydroxyde de glycine-sodium à pH 9,0 [69].
Afin de catalyser la production directe du stévioside à haute valeur ajoutée à partir de substrats moins coûteux, de raccourcir le temps de réaction et de réduire les coûts de production, les chercheurs ont mis au point un système en cascade multi-enzymes. Lorsque OsEUGT11, SrUGT76G1 et l’arabidopsis saccharose synthase AtSUS3 sont co-expriment, les bactéries recombinantes peuvent catalyser directement la production de Reb M à partir de Reb A, d’udp et de saccharose comme substrats [68]. La mutation du gène codant pour SrUGT76G1 dans la bactérie recombinante de sorte que la thréonine à la position 284 soit mutée en sérine augmente le rapport des produits catalysé par cellules entières Reb M et Reb D de 1:3,9 à 7:1, réduit la proportion du produit intermédiaire Reb D et augmente le rendement de Reb M [68]. La technologie d’immobilisation enzymatique peut augmenter la réutilisation des enzymes et réduire le coût des réactions enzymatiques.
En utilisant le glutaraldéhyde comme agent de réticulation et le chitosan comme support, OsEUGT11 et SrUGT76G1 exprimés dans Escherichia coli ont été liés par covalence à des microsphères de chitosan, respectivement, ce qui peut améliorer la stabilité de stockage et la réutilisation des enzymes recombinantes. Cependant, la production du cér M est limitée par le substrat coûteux du cér D. Afin de générer directement des cér M à partir du cér A bon marché en une seule étape, les chercheurs ont construit une réaction en cascade en immobilisant simultanément OsEUGT11 et SrUGT76G1 sur le chitosan. L’enzyme co-immobilisée obtenue utilise l’udpg comme donneur de sucre. Dans un tampon de phosphate de sodium à pH 7,0 avec 3 mmol/L MgCl2, le Reb a peut être directement catalysé pour générer du Reb M, qui est 3,2 fois plus actif que le système mixte d’immobilisation individuelle (Figure 4). Tampon de phosphate de sodium avec 3 mmol/L MgCl2 ajouté, le Reb a peut être directement converti en Reb M par catalyse enzymatique, et l’activité est 3,2 fois plus élevée que celle du système mixte seul (Figure 4), réduisant ainsi le coût de production du Reb M [63].
En résumé, la technologie biocatalytique est simple à utiliser, a une grande spécificité catalytique et produit peu de sous-produits, ce qui facilite la séparation et la purification subséquentes du produit, facilitant ainsi la production industrielle de glycosides de stéviol [70].
4 résumé et perspectives
En tant que nouveau type d’édulcorant naturel sans calories, la valeur alimentaire et médicinale du stévioside est également continuellement explorée. En 2018, le cér D et le cér M, encore plus sucrés, ont reçu une attention générale et devraient remplacer le cér A en tant que nouvelle génération d’édulcorants naturels. Cependant, le contenu du Reb D et du Reb M dans la stevia est extrêmement faible, et le coût d’extraction et de purification des plantes est élevé, ce qui limite leur application et leur développement.
La biosynthèse du stévioside est un moyen important de promouvoir la production efficace de Reb D et de Reb M. À l’avenir, l’efficacité de la biosynthèse du stévioside peut être améliorée de la manière suivante: (1) le nombre et l’activité des glycosyltransférases existantes sont limités. La bioinformatique peut être utilisée pour découvrir de nouveaux types de glycosyltransférase à haute efficacité, et utiliser la technologie de modification moléculaire pour améliorer le niveau d’expression, l’efficacité catalytique et la stabilité thermique de l’enzyme recombinante; (2) utiliser la technologie de la biologie synthétique pour construire des voies de synthèse du cér D et du cér M à partir du glucose dans des cellules microbiennes telles que Escherichia coli, et améliorer le rendement du cér D et du cér M en régulant des réseaux métaboliques connexes, en développant et en optimisant des éléments régulateurs de gènes, etc., afin d’augmenter le rendement de R E b D et R E b M; (3) développer l’immobilisation, la catalyse de cellules entières, les cascades multi-enzymatiques et les technologies de régénération de coenzyme pour réduire les coûts de production, accélérant ainsi l’application sur le marché du stevioside.
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