Quelle est la méthode de Production de la poudre D Allulose?

1 D-Allulose vue d’ensemble

D Allulose est un sucre hexose et un epimer C-3 de D-fructose. En raisSur lede sSur legoût sucré élevé, sA Aafaible teneur en énergie, ses fonctions physiologiques uniques et ses avantages potentiels pour lA asanté, le D-allulose est considéré comme un nouvel édulcorant à fort potentiel. Il est devenu un hotspot de recherche dans le domaine de lA abiosynthèse rare du sucre dans le monde entier. Cependant, lA aD-allulose est de nature extrêmement rare et difficile à synthétiser chimiquement. La méthode biosynthétique, par contre, a une procédure simple et a fait de grandes percées ces dernières années. Par conséquent, l’auteur passe en compte les récents progrès de la recherche dans la biosynthèse de D-allulose, y compris les propriétés physico-chimiques, les fonctions physiologiques, les applications, le métabolisme in En directet la productiSur leenzymatique de D-allulose, couvrant les sources, les propriétés enzymatiques, les structures cristallines, les mécanismes catalytiques, l’expressiSur lehétérologue, et les processus de séparation et de purification des enzymes clés impliqués.

1.1 propriétés physico-chimiques et sources de D-allulose

D-Allulose est un sucre six carboneAvec un point de fusion de 96 °C, soluble dans l’eau, et une densité de 1,35 g/cm3[1]. La douceur du D-allulose est de 70% celle du saccharose [2]. Le D-Allulose est un sucre réducteur et peut participer à des réactions de brunissement lors du traitement thermique. Le pouvoir calorifique de la D-allulose a été mesuré à 0,029 kJ/g dans une expérience chez le rat, ce qui représente 0,3% de l’énergie du saccharose, ce qui indique que la D-allulose a une énergie presque nulle [3-4]. La D-allulose est très rare dans la nature, et les sources végétales sont extrêmement rares [5]. De petites quantités d’allulose ont également été trouvées dans certaines bactéries [6], et la D-allulose n’est pEn tant queprésente chez les animaux. Allulose n’a pEn tant queété trouvé chez les animaux. Cependant, la D-allulose se trouve également dans divers aliments, comme le jus de fruits qui a subi un traitement de chauffage à long terme, et la teneur en D-allulose dans divers aliments est étroitement liée à la concentration en sucre, à la température et au temps de chauffage au cours du processus de La production[2, 7].

1.2 fonctions physiologiques et métabolisme de la D-allulose dans le corps

Le conseil des ministresFonctions physiologiques de D-alluloseRéduire l’absorption du D-fructose et du D-glucose alimentaires [8-9]; Améliorer la résistance à l’insuline [7, 10-11]; Activité anti-obésité [12-14]; Et abaisser les lipides sanguins [15]. Des études sur la voie métabolique de la D-allulose chez le rat ont montré que: 1) le transport de la D-allulose dans l’intestin est médié par le transporteur de glucose 5, eta une affinité plus faible pour le D-fructose [16-18]; 2) D-allulose n’est pas impliqué dans le métabolisme lié au glucose [19]; 3) la D-allulose ne peut pas être métabolisée dans le foie animal et ne peut donc pas favoriser la production d’énergie du foie [20]. Environ 98% de D-allulose est excrété du corps sous forme d’urine et de matières fécales après administration orale ou intraveineuse, et seule une petite quantité de D-allulose est décomposée en acides gras à chaîne courte par l’action des microorganismes présents dans le cécum [21].

1.3 Applications de D-allulose

D-Allulose a été approuvé en tant que produit généralement considéré comme sûr (GRAS) par la FDA des États-Unis en 2011 et est autorisé comme ingrédient alimentaire et complément alimentaire [4, 7]. Des études ont montré que l’apport maximal de D-allulose est de 0,55 g par kg de poids corporel par jour, et qu’il ne causera pas de diarrhée chez les humains dans cette fourchette [8-9].

D-Allulose a un large potentiel de marché dans l’industrie alimentaire en raison de sa faible teneur en calories, sa douceur élevée et ses fortes propriétés réductrices. Par exemple, la D-allulose peut améliorer de manière globale les propriétés de la protéine de blanc d’œuf par la réaction de Maillard, telles que l’excellente force du gel, la stabilité émulsionnante, les propriétés moussantes et l’activité antioxydante [22-23]. Le D-allulose peut également améliorer la qualité des produits laitiers fermentés, régulant le fort goût aigre du yogourt causé par la surfermentation, mais n’affecte pas l’activité probiotique de la souche de fermentation et les bienfaits probiotiques qu’il apporte au produit fermenté [21]. De plus, l’utilisation de 25% de D-allulose dans la cuisson, en combinaison avec d’autres additifs, peut produire des gâteaux sans sucre [24].

D-Allulose a également un large potentiel d’application dans d’autres domaines. Par exemple, les matériaux végétaux fabriqués à partir de D-allulose peuvent être utilisés comme films permanents, imperméables, respectueux de l’environnement, transmettant la lumière pour les appareils optiques et les écrans à cristaux liquides [25]. Le D-Allulose est également le premier insectifuge à base de sucre découvert, et a quelques effets positifs en inhibant la croissance des parasites [26-27]. La D-allulose est également un précurseur d’autres hexoses et joue un rôle extrêmement important dans la production de D-allose [28-29[traduction]et le D-allitol [30] joue un rôle extrêmement important.

2. Méthode enzymatique biologique

La méthode de synthèse chimique de D-allulose présente des inconvénients communs qui sont difficiles à surmonter, tels que des difficultés dans l’isolement, de nombreux sous-produits, et la production de déchets chimiques. Par conséquent, la méthode de production d’enzymes biologiques vertes et respectueuses de l’environnement a peu à peu reçu une attention généralisée dans le monde entier.

2.1.1 Source des enzymes de la famille des dteases

La famille des D-tagatose 3-éimerase (DTEases) est une enzyme qui catalyse l’isomérisation des keto monosaccharides en position C3 et est également l’enzyme de base pour la production de sucres rares [32]. La famille des enzymes DTEase comprend: D-tagatose 3-émaréase (DTEases) [33], D-allulose 3-émaréase (DAEase) [35], kétose 3-émaréase [36], qui ont toutes la propriété commune de catalyser la conversion du D-fructose en D-allulose.

Le gène codant pour la DTEase a été isolé séquentiellement à partir de Clostridiumcellulolyticum H10[37], de Ruminococcus sp.[38], de Clostridium scindens[34] et de Desmospora sp.[35], mais il est encore nécessaire d’exploration d’autres sources et de DTEase plus efficace [32, 37, 39-40] pour la production industrielle de D-allulose.

2.1.2 propriétés enzymatiques de la DTEase

Parmi la famille des enzymes DTEase, la D-allulose-3-epimérase(DTEase) est la plus efficace pour catalyser la réaction du D-fructose à la D-allulose. L’efficacité catalytique (Kcat/Km) des DAEases de C. cellulolyticum et A. tumefaciens est respectivement de 186,4 et 205 L/(mmol·min), ce qui est supérieur à celui de la DTEase (D-tagatose 3-epimerase) de Clostridium sp. (141,4 L/(mmol·min)) et Ruminococcus sp. (51 L/(mmol·min)) [34, 37-38], voir tableau 1.

Les ions métalliques sont fixés par liaison au D-fructose et jouent un rôle crucial dans la conversion du D-fructose en D-allulose. Les résidus Asp183 et His209 lient efficacement le substrat à travers les ions métalliques. La famille des enzymes DTEase a des degrés significativement différents de dépendance aux ions métalliques Mn2+, Co2+ et Mg2+ [41,44-45]. Cependant, l’activité enzymatique de DAEase de C. cellulolyticum et de DTEase de C. scindens est strictement dépendante des ions métalliques Mn2+ et Co2+[35,37].

2.1.3 structure cristalline de la DTEase

Parmi la famille des enzymes DTEase, les DAEases d’a. tumefaciens et de C. cellulolyticum présentent la forme la plus proche du tétramère. Dans le tétramère de DAEase, 34 liaisons hydrogène sont formées entre les résidus d’acides aminés dans les deux sous-unités. La forte activité catalytique de DAEase est attribuée à la vaste zone interfaciale accessible au solvant, qui est causée par des interactions étendues entre les deux dimers de l’enzyme de la famille DTEase [42]. En outre, le DAEase exprimé par des souches recombinantes présente encore d’excellentes propriétés enzymatiques. L’expression hétérologue de DAEase de C. cellulolyticum H10 a une demi-vie plus longue, des paramètres cinétiques plus élevés et une stabilité thermique plus élevée [37].

L’arrangement quaternaire de DAEase est une unité asymétrique composée de quatre sous-unités identiques A, B, C et D. le site actif contient quatre résidus de l’ion métallique, coordination octaédrique de deux molécules d’eau. Ces quatre sous-unités sont des dimères apparentés par symétrie cristalline, dans lesquelles les sous-unités A et D interagissent entre elles, toutes deux en contact étroit avec les sous-unités B et C. le site actif de DAEase est exposé sur la même face antérieure du dimère. Ces dimères stables offrent une excellente surface accessible pour fixer les substrats sur la face avant du dimère [16].

La rainure hydrophobe du site actif et la surface accessible sont situées entre les sous-unités A et B. Le côté sous-unité de DAEase est fermé et exposé aux deux extrémités de la structure du baril. Dans le tétramer de DAEase, les deux dimères sont enfermés sur les côtés de la structure du baril. Chaque monomère (sous-unités A, B, C et D) est composé de 8 unités répétées de structures (β/α). Chaque monomère est composé de 13 hélices α et de 8 plis β, formant la structure principale du monomère [16].

2.1.4 mécanisme catalytique de la DTEase

L’action catalytique de la famille des enzymes DTEase dépend de la disposition moléculaire des sous-unités. Leurs sites actifs sont situés sur le substrat pour obtenir des réactions enzymatiques efficaces. Mn2+ et deux molécules d’eau et quatre acides aminés (Glu, Asp, His et Glu) forment une coordination octaédrique, et ces quatre résidus d’acides aminés sont complètement conservés dans toutes les kétose 3-epiméases. Six résidus (Glul50/Glul52, Aspl83 / Aspl85, His209 / His211, Glu244 / Glu246, Glul56/ Glu158, His185/His188) de DAEase chez A. tumefaciens et DTEase chez P. cichorii sont importants pour la fixation du substrat et la stabilité thermique lors de la mutagénèse dirigée vers le site.

Après que le substrat remplace la molécule d’eau, le site actif subit une diastéréoisomérisation. Deux résidus, le Glu50 et le Glu244, en collaboration avec Mn2+, éliminent le proton C3 de D-fructose pour former le cis-diol intermédiaire de D-allulose, et la D-allulose est libérée de la position entre la liaison hydrogène et la molécule d’eau sur le site actif DAEase.

Actuellement, des modifications moléculaires sont en cours sur des enzymes de la famille des dteases afin d’améliorer leur activité catalytique et leur stabilité thermique. La mutagénèse dirigée par le site a été utilisée pour améliorer la stabilité thermique et le comportement catalytique de l’isomérase de L-rhamnoseprovenant d’obsidiansis caldicellulosirupteur dans la production de D-allulose. Les résidus hydrophobes de la boucle β1-α1 ont été complètement remplacés par des acides aminés polaires. Comparativement à l’enzyme de type sauvage, les activités relatives des mutants V48N/G59N/I63N et V48N/G59N/I63N/F335S ont des activités relatives respectivement supérieures de 105,6 % et de 134,1 % à celles de l’enzyme de type sauvage [57]. La mutagénèse dirigée sur le site a également amélioré la stabilité thermique de la d-allulose-3-epimérase (DAEase) de Dorea sp. [50].

La recherche sur le mécanisme catalytique des enzymes de la famille des dteases en est encore à ses débuts, et la relation entre la structure enzymatique et la fonction catalytique nécessite des études plus approfondies. En outre, la stabilité thermique et la spécificité du substrat de DTEase présentent encore quelques lacunes. Dans la production de sucres rares, la spécificité du substrat des enzymes de la famille des dteases devrait être davantage utilisée pour atteindre la production efficace et verte de sucres rares fonctionnels.

2.1.5 expression hétérologue de la DTEase

La plupart des enzymes de la famille DTEase ont été identifiées et isolées à partir de bactéries, et le nombre d’enzymes exprimées en souches naturelles est loin de répondre aux exigences des applications. Par conséquent, la construction de vecteurs d’expression et leur expression dans des organismes hétérologues est d’une grande importance dans les études de caractérisation et les applications enzymatiques.

Bacillus subtilis, Escherichia coli et la levure sont couramment utilisés pour construire des systèmes recombinants pour l’expression des DAEase. Contrairement à E. coli, Bacillus subtilis n’a pas de membrane externe, de sorte que les protéines qu’il sécrète peuvent être libérées directement dans le milieu de culture. Bacillus subtilis est également de qualité alimentaire et ne sécrète pas de lipopolysaccharides calorifères (endotoxines) dans les protéines qu’il sécrète. La bactérie génétiquement modifiée Escherichia coli (E. coli) présente les avantages d’un contexte génétique clair, d’un système complet de récepteurs vectoriels, d’une croissance rapide, d’une culture simple et d’une stabilité recombinante. De plus, le système d’expression de levure présente les caractéristiques de conditions de culture simples, de croissance rapide, de niveaux d’expression élevés et de fonctionnement simple. Après la traduction, la protéine peut être traitée et correctement modifiée. Les inconvénients du système d’expression de la levure sont une faible expression génétique clonée, un long temps de fermentation, une glycosylation incorrecte des protéines et une résistance à la division cellulaire. De plus, la forte concentration de polysaccharides dans le surnageant n’est pas propice à la purification des protéines recombinantes.

Les premiers chercheurs avaient tendance à utiliser E. coli comme bactérie hôte pour étudier l’expression et l’enzymologie des enzymes de la famille des dteases [34, 37]. Récemment, de nombreux chercheurs ont utilisé Bacillus subtilis et la levure comme bactéries hôtes pour exprimer des enzymes de la famille DTEase pour la production de D-allulose [35]. Le gène DAEase d’a. tumefaciens a été exprimé dans E. coli et K. marxienaprès recombinaison et utilisé pour la production d’allulose, et les rendements de D-allulose ont atteint 230 g/L [53] et 190 g/L [56] respectivement. Comparativement, l’enzyme DAEase exprimé dans A. tumefaciens à l’aide du système d’expression E. coli a le niveau d’expression le plus élevé à ce jour, comme le montre le tableau 2.

(1) (1) Système d’expression E. coli: le système d’expression E. coli présente les avantages d’un faible coût et d’une efficacité d’expression élevée. La famille des enzymes DTEase peut être surexprimée dans E. coli sous forme de protéines solubles. L’enzyme DTEase recombinante est séparée et purifiée par chromatographie d’affinité, et le rendement de D-allulose est de 120-218 g/L, avec un taux de conversion de 24%-33% [34]. Le rendement et l’efficacité de conversion de l’enzyme DAEase exprimé dans Escherichia coli recombinant à l’aide de la méthode de réponse de cellules entières d’agrobacterium tumefaciens étaient respectivement de 230 g/L et de 33% [53].

(2) système d’expression du bacille: le Bacillus subtilis Recombinant portant le gène codant DAEase peut surexpress l’enzyme DAEase de manière à haute efficacité et à faible coût. Le DAEase Recombinant immobilisé sur une matrice de résine d’échange anionique peut favoriser la production stable et efficace d’allulose. Le DAEase recombinant exprimé dans Bacillus subtilis B. subtilis a une activité de 58,6 U/mg, ce qui est plus élevé que chez E. coli (8,95 U/mg). En outre, l’élément régulateur de l’expression de DAEase affecte également la quantité et l’activité de l’enzyme. Chez Bacillus subtilis B. subtilis, le vecteur pMA5- Pxy/A-RDPE peut exprimer de façon stable DAEase avec une activité enzymatique de 95 U/mL. Cette valeur est supérieure à l’activité enzymatique exprimée dans E. coli E. coli avec le vecteur pBluescript-SK-DTE [54].

3) système d’expression de levure:

Le gène exogène DAEase peut être fortement exprimé dans les recombinants S. cerevisiae [55] et Kluyveromycesmarxianus [56]. Le vecteur d’expression pRS424-TEFpr-ss-xy/A, porteur du gène DAEase d’a. tumefaciens, peut exprimer une protéine d’une masse moléculaire relative de 33 000 chez S. cerevisiae AN120 [55]. Le gène xylose isomérase de T. thermophilus et le gène DAEase d’a. tumefaciens sont co-exprimés dans les spores de levure pour améliorer la catalyse synergique. Les deux enzymes recombinantes ont été immobilisées et la D-allulose a été produite en utilisant le D-glucose comme substrat [55]. L’isomérase de xylose recombinante catalyse la conversion du D-glucose en D-fructose, et le DAEase recombinant convertit le D-fructose en D-allulose. Yang et Al., et al.ont fourni une approche précieuse pour régénérer les cellules de K. marxianus modifiées, qui peuvent produire de la D-allulose par recyclage catalytique [56]. Le K. marxianus recombinant a produit 190 g/L de D-allulose à partir d’une concentration de substrat de 750 g/L de D-fructose en 12 heures, et environ 100 g de D-fructose résiduel ont été convertis par les bactéries artificielles en 34 g d’éthanol. De plus, l’idée de produire de la D-allulose par biocatalyse de cellules entières a également été proposée [56].

2.2 séparation et purification de la D-allulose

La séparation et la purification de la D-allulose comprennent principalement les deux méthodes suivantes: la première méthode est la résine échangeuse d’ions. Une matrice de résine d’échange anionique et une chromatographie à lit mobile simultanée ont été utilisées pour immobiliser l’enzyme DAEase afin de produire de la D-allulose à partir du D-fructose comme substrat. En dialyse par résine échangeuse d’ions, les cellules de R. sphaeroides SK011 peuvent produire 6,5 g/L de D-allulose à partir d’une concentration initiale de substrat de 50 g/L de D-fructose [39], avec un taux de production de 0,82 g·h-1. Pour un système mixte contenant de la D-allulose et du d-fructose, la D-allulose a d’abord été convertie en acide gluconique puis purifiée à 91,2% par résine échangeuse d’anions [57].

La deuxième méthode utilise une méthode biologique pour purifier la D-allulose. Dans un système mixte contenant du D-allulose et du D-fructose, la D-allulose a été obtenue en utilisant de la levure pour consommer le D-fructose restant et produire de l’éthanol. De plus, une combinaison d’évaporation osmotique, de chromatographie à échange cationique et de méthodes biologiques a été utilisée pour séparer et purifier le D-allulose, d’une pureté allant jusqu’à 86,2% [58].

3 Discussion

D-Allulose est l’epimer C-3 du D-fructose, qui a de nombreuses fonctions physiologiques et est largement utilisé dans la nourriture, la médecine et les soins de santé. Après que la FDA américaine a adopté une mesure favorable en avril 2019 pour exclure l’allulose du comptage des sucres ajoutés et des sucres totaux, les grandes entreprises ont commencé à prendre un grEt en plusintérêt pour l’allulose. Actuellement, le monde et#39; S principaux producteurs de D-allulose, dont la Corée du Sud.#39; S cjce CheilJedang, Royaume-Uni#39; S Tate &Lyle et le Japon#39; S Matsutani groupe, tous utilisent des méthodes biologiques pour produire de la D-allulose. Par conséquent, la construction de bactéries génétiquement modifiées qui peuvent catalyser la production de D-allulose est une base importante pour l’industrialisation de D-allulose. Bien que l’allulose ne puisse actuellement être utilisée légalement que dans quelques pays, il est certain qu’elle deviendra un édulcorant majeur à l’avenir.

Bien qu’il y ait eu des percées majeures dans la recherche de la méthode enzymatique biologique pour la D-allulose, en particulier le développement rapide de la technologie d’extraction génétique et de construction cellulaire, les perspectives industrielles de la production biologique de D-allulose restent incertaines. Des recherches ultérieures peuvent être menées dans les deux domaines suivants: 1) le criblage d’enzymes de la famille DTEase ayant une activité et une stabilité élevées au moyen de méthodes d’extraction de gènes, l’établissement de méthodes de criblage efficaces à haut débit et la modification moléculaire d’enzymes de la famille DTEase pour mieux répondre aux besoins de l’industrialisation, permettant ainsi une conversion efficace du D-fructose et de la D-allulose; 2) la préparation industrielle de D-allulose étant confrontée au problème de l’élimination du D-fructose résiduel dans le mélange après catalyse enzymatique, la séparation et la purification de D-allulose augmentent son coût de production. A l’heure actuelle, il existe relativement peu d’études sur la séparation, l’épuration et la cristallisation du D-allulose, ce qui indique que l’industrialisation en aval est relativement en retard. Il est nécessaire de réduire davantage le coût de production industriel de D-allulose et d’améliorer l’efficacité de production de D-allulose en simplifiant les étapes du processus en aval, telles que la séparation et la purification, la cristallisation, le séchage et d’autres étapes du processus.

La Figure 1 montre une technologie de procédé écologique et recyclable plus avancée pour le D-allulose [16]. L’ensemble du système de réaction est divisé entre le bioréacteur A (pour l’hydrolyse du saccharose et la conversion enzymatique en D-allulose) et le bioréacteur B (pour la production d’éthanol, la séparation D-allulose et la propagation de la levure). Le jus de canne à sucre brut ou le jus de sorgho doux est utilisé comme matière première pour produire du saccharose. La levure modifiée utilisée contient de l’isomérase naturelle du saccharose et un gène d’enzyme exogène recombinant de la famille de la DTEase, de sorte que la levure modifiée peut produire du D-glucose et du D-fructose en hydrolysant le saccharose avec de l’isomérase du saccharose. Le D-fructose est converti en D-allulose par l’enzyme de la famille DTEase à 55~60 °C, et le reste du D-glucose et du D-fructose sont fermentés pour produire de l’éthanol à 27-30 °C, et l’éthanol peut être recueilli et utilisé comme carburant. Les avantages de cette méthode sont les faibles coûts des matières premières, l’utilisation de produits intermédiaires générés au cours du processus autant que possible, la réduction des lourdes étapes de séparation et de purification, ainsi que la réduction de la formation de déchets, une consommation d’énergie plus faible et des rendements plus élevés en sucre.

4 perspectives

Actuellement, le D-allulose est produit industriellement à la tonne en Chine, au Japon, en Corée du Sud, aux États-Unis et au Royaume-Uni. Pour se démarquer dans la concurrence féroce de l’industrie, les entreprises produisant D-allulose doivent améliorer la technologie de chaque maillon dans le processus. Actuellement, les principaux obstacles à la production sont la faible activité de l’isomérase, le faible taux de conversion et la faible fréquence de réutilisation. Par conséquent, l’amélioration de l’activité enzymatique, de la stabilité et de l’efficacité catalytique devraient être les objectifs clés de la recherche et du développement futurs de la famille des enzymes DTEase. Le coût de production de D-allulose peut être réduit en améliorant les processus de décoloration, dessalement, cristallisation et séchage. La conception rationnelle ou la modification de procédés déraisonnables utilisant une technologie efficace de criblage à haut débit est un moyen direct de changer la structure de la famille des enzymes DTEase. En améliorant la famille des enzymes DTEase et en améliorant le processus de production, le coût de production de D-allulose peut être réduit et son prix abaissé, assurant ainsi que D-allulose peut être facilement fourni aux consommateurs.

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