4 Haematococcus Pluvialis méthodes d’analyse de l’astaxanthine

Astaxanthine, chimiquement nommée 3,3' dihydroxy-bêta, bêta et#39; -carotène 4,4'-dione, appartient aux cétocaroténoïdes. Des études ont montré que l’astaxanthine est l’antioxydant naturel le plus fort [1-2]. L’astaxanthine a des fonctions antioxydantes, anti-radiation, anti-vieillissement, anti-tumeur et de préventIon ionet de traitement des maladies cardiovasculaires [2-3], et a donc une valeur économique extrêmement élevée. Il a été utilisé dans les produits de santé, les médicaments, les additifs alimentaires, les cosmétiques, les aliments fonctionnels, les additifs alimentaires et d’autres domaines [4].

Les principales matières premières pour la production d’astaxanthine proviennent des coquilles de crevettes et de crabes [3,5], d’haematococcus pluvialis [4] et de Rhodotorula glutinis [6] [traduction]. Parmi eux, hématocoquepluvialis peut accumuler de l’astaxanthine jusqu’à 5% du poids sec dans des conditions de stress. Comme la structure de l’astaxanthine contient deux atomes chiraux de C, la structure chez hématocoquepluvialis est 3S, 3S', et la forme synthétique est un mélange chiral, principalement 3R, 3R'. Haematococcus pluvialis est considéré comme la meilleure source de production naturelle d’astaxanthine.

Haematococcus pluvialis forme une paroi extérieure gélatineuse en forme de coquille après un stress. Lorsque le pigment dans les cellules est extrait, il est difficile pour les solvants conventionnels d’entrer à l’intérieur des cellules pour extraire le pigment. Il est généralement nécessaire de combiner une méthode de rupture de la paroi cellulaire. Deuxièmement, l’astaxanthine dans les cellules d’haematococcus pluvialis existe principalement sous forme d’Les estersd’astaxanthine, c’est-à-dire de molécules monoester et de molécules diester avec différentes chaînes d’acyle. L’analyse HPLC est difficile à réaliser la séparation de base de toutes les molécules, et le poids moléculaire est différent lors du calcul du contenu.

En outre, l’astaxanthine est instable et sujette à la dégradation dans des conditions telles que la lumière et la chaleur, il y a donc certains problèmes avec la détermination précise de l’astaxanthine. Cet article passe en revue l’état actuel de la recherche en termes d’extraction, d’hydrolyse et de détection deAstaxanthine de Haematococcus pluvialis, en vue de fournir des indications sur le choix de méthodes appropriées pour la détermination rapide de la teneur en astaxanthine chez Haematococcus pluvialis à des fins différentes.

1 Extraction d’astaxanthine de Haematococcus pluvialis

L’extractionde l’astaxanthine est la base pour la détermination précise de son contenu et est également l’un des aspects incertains de la mesure de l’astaxanthine. Dans des conditions de stress, les cellules d’haematococcus pluvialis accumulent de l’astaxanthine, mais leur croissance et leur division s’arrêtent, formant des spores immobiles, c’est-à-dire des cellules gélatineuses. Les cellules gélatineuses matures ont une paroi cellulaire dure et épaisse à trois couches, la couche la plus extérieure étant l’algaène, un matériau très résistant à l’hydrolyse de l’acide acétique. Les deuxième et troisième couches sont composées de mannose et de cellulose réparties uniformément et non uniformément [7].

Pour Haematococcus pluvialis à paroi cellulaire gélatineuse, les méthodes conventionnelles de dissolution et d’extraction ne peuvent pas accéder à l’intérieur de la cellule pour extraire le pigment.

Actuellement, dans l’industrie, la technologie d’extraction supercritique du CO2 [7], la technologie d’extraction d’homogénéisation haute pression/ultra-haute pression [8] et la méthode de cavitation sous pression négative [9] sont utilisées pour extraire l’astaxanthine d’haematococcus pluvialis. Les méthodes ci-dessus peuvent extraire efficacement l’astaxanthine, mais elles nécessitent une grande quantité de poudre d’algues et sont compliquées à opérer, de sorte qu’elles conviennent à la production industrielle à grande échelle. Les méthodes d’extraction utilisées pour détecter l’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis comprennent l’extraction au solvant, le broyage mécanique + l’extraction au solvant, l’extraction au diméthyl sulfoxide (DMSO) et la rupture de la paroi de la cellulase + l’extraction au solvant.

1.1 méthode d’extraction au solvant

La méthode d’extraction au solvant est facile à utiliser, peu coûteuse et nécessite peu d’équipement. Il suffit d’optimiser le solvant d’extraction, le rapport liquide-solvant, la température d’extraction et le temps d’extraction. Les solvants couramment utilisés sont l’acétone [10], l’acétate d’éthyle, le dichlorométhane, l’éthanol, etc. Cependant, en raison de la paroi externe de la coquille gélatineuse d’haematococcus pluvialis, les solvants conventionnels ne peuvent pas pénétrer dans les cellules et le taux d’extraction de l’astaxanthine est faible. Mendes-Pinto et al. ont signalé que l’acétone était utilisée comme solvant d’extraction de l’astaxanthine d’haematococcus pluvialis et que le taux d’extraction n’était que de 4 mg ·g-1 (masse d’astaxanthine extraite par gramme de poudre d’algues), tandis que le broyage mécanique + extraction d’acétone était de 19 mg ·g-1, ce qui indique que le solvant ne pouvait pas pénétrer dans les cellules pour extraire l’astaxanthine [10].

Ruen-ngam a comparé les méthodes d’extraction au solvant assistées par ultrasons (extraction assistée par ultrasons), micro-ondes (extraction assistée par micro-ondes) et Soxhlet (extraction par Soxhlet). Le taux d’extraction de l’astaxanthine a atteint 74% en utilisant une extraction assistée par micro-ondes à 75 °C pendant 5 minutes [11]. De plus, pour améliorer l’efficacité d’extraction du solvant, la perturbation chimique de la paroi cellulaire consiste à traiter les cellules d’haematococcus pluvialis avec des acides ou des alcalis. Sarada et al. ont rapporté que le traitement des cellules avec une solution d’acide chlorhydrique 2 mol·L-1 à 70 °C pendant 2 minutes, suivie d’une extraction avec un solvant, peut atteindre un taux d’extraction de l’astaxanthine de 86%-94% [12]. Cependant, il convient de noter que placer l’astaxanthine dans une concentration élevée de solution acide ou alcaline peut facilement causer la dégradation de l’astaxanthine. Les résultats ci-dessus montrent qu’en raison de la composition spéciale de la paroi cellulaire d’haematococcus pluvialis, l’extraction directe par solvant ne peut pas pénétrer dans les cellules, tandis que les traitements auxiliaires par ultrasons, micro-ondes et acidobasique sont tous susceptibles de provoquer une dégradation de l’astaxanthine et ne sont pas appropriés pour l’extraction de l’astaxanthine.

1.2 rupture mécanique de la paroi cellulaire + extraction au solvant

La rupture mécanique de la paroi cellulaire est la méthode la plus couramment utilisée en laboratoire, qui utilise des forces externes pour briser les parois cellulaires d’haematococcus pluvialis. Dans la norme nationale pour la détection deAstaxanthine chez Haematococcus pluvialisGB/T 31520-2015 [13] [en], Haematococcus pluvialis est soigneusement broyé à l’aide d’un homogénéisateur de verre, et ses pigments sont extraits en utilisant le dichlorométhane-méthanol comme solvant. La méthode de broyage mécanique + extraction au solvant est plus couramment utilisée dans la détection de l’astaxanthine [10, 14-16]. L’écrasement mécanique peut endommager les parois cellulaires et le pigment peut être complètement extrait. La méthode est simple à utiliser, mais elle exige que chaque échantillon soit broyé à travers un homogénéisateur de cellules, ce qui est long et laborieux.

1.3 rupture de la paroi de la Cellulase + extraction au solvant

Comme la paroi cellulaire d’haematococcus pluvialis est principalement composée de substances telles que la cellulose, la pectine et les lipopolysaccharides, la cellulase, la pectinase et la polysaccharidase sont utilisées pour briser la paroi cellulaire d’haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. ont exploré une nouvelle méthode enzymatique pour extraire l’astaxanthine de Haematococcus pluvialis [17] [traduction]. Cellulase: hydrolyse enzymatique de poudre algale, extraction à l’éthanol. Les conditions optimales pour l’extraction enzymatique sont: pH initial de la solution enzymatique 4,5, température d’hydrolyse enzymatique 45 °C, dosage enzymatique 1,5 % et temps d’hydrolyse enzymatique 15 h. Dans ces conditions, le taux d’extraction de l’astaxanthine était de 94,6 %, ce qui est 61,5 % plus élevé que la méthode traditionnelle d’extraction directe à l’éthanol. Il présente les avantages de la basse température de fonctionnement, de moins de pollution, de coût bas, et du taux élevé d’extraction. Il est facile d’obtenir une production industrielle verte, mais cette méthode prend du temps et des températures élevées peuvent également causer la dégradation de l’astaxanthine.

1.4 méthode d’extraction DMSO

DMSO a une bonne miscibilité avec divers solvants et une bonne perméabilité aux cellules. Il est souvent utilisé comme activateur de perméation pour les médicaments ou les pesticides et comme agent protecteur dans la cryoconservation des cellules. Seely a d’abord signalé que le DMSO peut être utilisé pour extraire la chlorophylle microalgues et les caroténoïdes [18] [traduction]. Boussiba et al. ont utilisé le DMSO pour extraire les pigments d’haematococcus pluvialis. L’extraction a été effectuée dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min, et le résidu d’algues peut être rendu incolore en répétant l’extraction 2 à 3 fois dans un bain-marie à 70 °C [19], ce qui montre que le DMSO a une bonne perméabilité et peut pénétrer dans les cellules d’haematococcus pluvialis pour extraire complètement l’astaxanthine. L’extraction du DMSO ne nécessite pas de traitement des parois cellulaires d’haematococcus pluvialis, ce qui simplifie grandement le processus d’extraction de l’astaxanthine, et a été utilisée dans la détection de l’astaxanthine [20-21]. En outre, le monde et#39; S grandes entreprises de microalgues, telles que Cyanotech, Fuji au Japon et en Chine.#39; S Green, une société de bioingénierie [8], A tous appliqué la méthode DMSO pour extraire l’astaxanthine d’haematococcus pluvialis à la détection de l’astaxanthine.

L’utilisation de DMSO comme agent de gonflement peut augmenter la perméabilité de la paroi cellulaire, et peut être utilisé comme extractif pour l’astaxanthine de Haematococcus pluvialis, simplifiant le processus de rupture de la paroi cellulaire nécessaire à la détection d’haematococcus pluvialis.

2 hydrolyse des esters d’astaxanthine

L’astaxanthine accumulée dans Haematococcus pluvialis est all-trans 3S, 3S 'configuration, avec un groupe hydroxyle dans chaque structure endocyclique. Il est habituellement estérifié avec des acides gras C16, C18 ou C20 pour former des esters d’astaxanthine pour stabiliser sa structure [22]. La plupart d’entre eux sont des monoesters d’astaxanthine, représentant environ 75%, diesters de l’astaxanthine représentant environ 20%, et l’astaxanthine libre représentant seulement 5% [12,23]. Il existe jusqu’à 30 types différents de monoesters et de diesters d’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis [24]. La complexité des esters d’astaxanthine rend la purification et la La quantificationdirecte et précise problématique. Par conséquent, les esters d’astaxanthine extraits doivent être hydrolysés en astaxanthine libre pour obtenir la purification d’une seule substance et une quantification précise par HPLC. Il existe généralement deux méthodes d’hydrolyse des esters d’astaxanthine: la saponification et l’hydrolyse enzymatique.

2.1 Saponification

La Saponification est généralement effectuée dans une solution de NaOH ou de KOH méthanol pour hydrolyser les esters d’astaxanthine en astaxanthine libre. Yuan et al. ont montré qu’une concentration élevée d’alcali ou une température de réaction pendant la saponification favorise l’hydrolyse des esters d’astaxanthine, mais accélère également la dégradation de l’astaxanthine [14] [traduction]. Chen Xingcai et al. ont également montré que la concentration d’astaxanthine libre diminuait linéairement avec l’augmentation de la concentration d’alcali [25] [traduction]. Yuan et al. ont étudié la cinétique d’hydrolyse de l’astaxanthine sous saponification à l’ester et la dégradation de l’astaxanthine sous différentes concentrations alcalines. Les résultats ont montré que dans un système de réaction à 22 °C avec une concentration de NaOH de 0,0175 ~ 0,020 mol · L-1, l’ester d’astaxanthine était complètement hydrolysé et aucune dégradation de l’astaxanthine ne se produisait. Cependant, une concentration plus élevée de la solution naoh-méthanol ou une température de réaction plus élevée ont causé une dégradation importante de l’astaxanthine [26] [en]. Les conditions de la méthode de saponification des esters d’astaxanthine sont dures. La concentration de la solution alcaline, la température de saponification et le temps pendant le processus de saponification affectent tous l’efficacité de la saponification et la stabilité de l’astaxanthine, qui est un autre aspect qui affecte la détermination précise de l’astaxanthine.

2.2 méthode d’hydrolyse enzymatique

Zhao a rapporté qu’une estérase alcaline soluble dans l’eau de Penicilium cyclopium peut convertir les esters d’astaxanthine en astaxanthine. Les conditions de réaction étaient l’incubation à 28 °C sous agitation pendant 7 h, et la récupération de l’astaxanthine a atteint 63,2 % [27]. Cependant, cette enzyme a une faible efficacité d’hydrolyse et n’a pas été largement utilisée dans la détermination de la teneur en astaxanthine. Jacobs a d’abord signalé que le cholestérol estérase liposoluble peut rapidement hydrolyser les esters caroténoïdes [28]. Bien qu’il existe actuellement peu de rapports dans la littérature sur cette méthode enzymatique, elle est utilisée par les sociétés nationales et étrangères produisant l’astaxanthine comme méthode douce d’hydrolyse. L’estérase de cholestérol utilisée non seulement hydrolyse complètement l’ester d’astaxanthine, mais aussi ne provoque pas facilement l’oxydation de l’astaxanthine, qui peut déterminer plus précisément la teneur en astaxanthine.

L’utilisation du cholestérol estérase sur l’extrait d’haematococcus pluvialis contenant de l’astaxanthine pendant une courte période améliore considérablement l’efficacité de détection de l’astaxanthine dans Haematococcus pluvialis.

3 détection Quantitative de l’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis

Les principales méthodes de détection de l’astaxanthine sont la spectrophotométrie, l’hydrolysis-hplc et HPLC-MS.

3.1 spectrophotométrie

Boussiba a rapporté que la chlorophylle d’haematococcus pluvialis a été détruite par chauffage avec une solution de méthanol à 5% KOH-30% pendant environ 10 minutes, puis l’astaxanthine a été extraite avec le DMSO. L’absorbance a été mesurée à une longueur d’onde de 475 nm pour calculer la concentration d’astaxanthine. Cette méthode permet d’estimer rapidement la teneur en astaxanthine et est largement utilisée en culture et en production [12,29]. Cependant, certains rapports ont montré que le traitement de la solution alcaline pour détruire la chlorophylle dans cette méthode provoque une dégradation de 25% à 40% de l’astaxanthine [16] [traduction].

Par conséquent, Li et al. ont amélioré Boussiba&#Procédé 39; S par extraction directe de DMSO sans traitement alcaldanset détection à une longueur d’onde de lumière visible de 530 nm pour éviter l’interférence d’autres caroténoïdes et de la chlorophylle. Cette méthode a été utilisée pour la détection rapide de la teneur en astaxanthine chez Haematococcus pluvialis [16]. Geng Jinfeng&#Les recherches montrent que la teneur en caroténoïdes et en astaxanthine d’haematococcus pluvialis pendant le processus de culture est en relation linéaire stable. En utilisant une méthode qui mesure directement et facilement les caroténoïdes et obtient indirectement la teneur en astaxanthine, la teneur en caroténoïdes peut être rapidement déterminée, puis en se basant sur la corrélation entre les caroténoïdes obtenus et l’astaxanthine, la teneur en astaxanthine dans Haematococcus pluvialis peut être rapidement calculée. Les données de ce laboratoire montrent également qu’il existe une bonne relation linéaire entre la teneur en caroténoïdes mesurée par spectrophotométrie et la teneur en astaxanthine mesurée par hydrolyse-hplc enzymatique (Figure 1). Ainsi, la méthode d’extraction DMSO peut être directement utilisée pour déterminer la teneur en astaxanthine en utilisant la méthode spectrophotométrique à 475 nm et la relation de la Figure 1.

3.2 méthode de l’hydrolysis-hplc

Après le prétraitement du pigment d’haematococcus pluvialis par saponification ou hydrolyse enzymatique, la CLHP peut être utilisée pour déterminer avec précision l’astaxanthine libre. À l’heure actuelle, la norme nationale pour la détermination de l’astaxanthine GB/T 31520-2015 utilise la méthode de CLHP après saponification pour la détermination [13]. La colonne de séparation est une colonne C30 de phase inverse, et la détection de l’astaxanthine entièrement trans-libre, 9-cis- astaxanthine, et 13-cis-astaxanthine peut être détectée en 20 min. Yuan a utilisé une colonne C18 pour analyser l’astaxanthine estérifiée avec de la saponine. Le méthanol, le dichlorométhane, l’acétonitrile et l’eau ont été utilisés comme phase mobile pour l’élution par gradient, et un seul échantillon a été détecté en 16mdans[30] [en]. Cyanotechnique &#La méthode de détermination de la teneur en Haematococcus pluvialis consiste à extraire le pigment puis à l’hydrolyser pour le dosage par CLHP. Ce prétraitement par hydrolyse convertit les esters d’astaxanthine en astaxanthine, qui convertit les composants mélangés contenant des composés d’astaxanthine dans la détection d’un seul composant d’astaxanthine, rendant l’analyse HPLC plus simple, permettant une quantification précise, et avec une haute répétabilité. D’autres conditions de séparation par chromatographie en phase inversée de l’astaxanthine sont résumées dans le tableau 1.

3.3 méthode HPLC-MS

En raison de la diversité et de la complexité de l’extraction de l’astaxanthine et de ses dérivés ester, la spectrophotométrie conventionnelle et les méthodes HPLC ne peuvent pas identifier les différences entre les différentes molécules ester astaxanthine. La spectrométrie de masse peut mieux distinguer entre les différentes molécules en utilisant les différences dans la masse et l’information de fragment entre les molécules d’ester d’astaxanthine, puis effectuer des analyses qualitatives et quantitatives. La méthode de mesure directe de l’échantillon de pigment extrait par HPLC/MS sans traitement évite la dégradation de l’astaxanthine pendant le processus de saponification, et peut mesurer simultanément l’astaxanthine, les esters d’astaxanthine, d’autres caroténoïdes et la chlorophylle.

Il a certaines applications dans la détermination de la composition de l’astaxanthine et l’étude des mécanismes métaboliques de l’astaxanthine. Holtin et al. ont utilisé la MS LC-(APCI) pour analyser qualitativement les isomères libres d’astaxanthine, les monoesters d’astaxanthine, les diesters d’astaxanthine et la lutéine chez Haematococcus pluvialis [24]. Weesepoel et al. ont utilisé ESI-IT et MADIL-TOF/TOF pour effectuer une analyse plus détaillée des esters d’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis, y compris la détermination de la chaîne acyle de l’ester d’astaxanthine et la distinction entre les isomères cis et trans [32]. D’autres séparations chromatographiques de l’astaxanthine et de ses dérivés ester sont résumées dans le tableau 1. Il convient de noter que la faible polarité des caroténoïdes et des esters d’astaxanthine rend difficile leur ionisation en utilisant la source d’ions ESI à ionisation douce couramment utilisée. La source d’ions APCI est plus couramment utilisée pour l’analyse des esters d’astaxanthine.

Cet article passe en revue et évalue les méthodes actuelles d’extraction, d’hydrolyse et de détection desAstaxanthine chez Haematococcus pluvialis....... La teneur en astaxanthine est directement mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 475 nm après extraction au DMSO. La teneur en astaxanthine est rapidement calculée sur la base de la relation linéaire entre la teneur en caroténoïdes mesurée par spectrophotométrie et la teneur en astaxanthine mesurée par HPLC. Cette méthode est plus propice à l’obtention rapide de paramètres importants au cours de la recherche. Après l’extraction de DMSO, le cholestérol estérase est utilisé pour l’hydrolyse, et la CLHP est utilisée pour déterminer la teneur en astaxanthine libre, qui peut être utilisée comme méthode pour déterminer avec précision la teneur en astaxanthine. Pour différentes fins de détection, différentes méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse, et la comparaison des données entre différents laboratoires ou méthodes devrait être corrigée en fonction des résultats après le traitement d’hydrolyse de l’échantillon extrait et l’analyse par CLHP.

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