4 Haematococcus Pluvialis méthodes d’analyse de l’astaxanthine

Astaxanthine, chimiquement nommée 3,3' dihydroxy-bêta, bêta et#39; -carotène 4,4'-dione, appartient aux cétocaroténoïdes....... Des études ont montré que l’astaxanthine est l’antioxydant naturel le plus fort [1-2]. L’astaxanthine a des fonctions antioxydantes, anti-radiation, anti-vieillissement, anti-tumeur et de préventIon ionet de traitement des maladies cardiovasculaires [2-3], et a donc une valeur économique extrêmement élevée. Il a été utilisé dans les produits de santé, les médicaments, les additifs alimentaires, les cosmétiques, les aliments fonctionnels, les additifs alimentaires et d’autres domaines [4].

The madansraw materials pourtheProduction d’astaxanthineProviennent de coquilles de crevettes et de crabes [3,5], d’haematococcus pluvialis [4] et de Rhodotorula glutinis [6] [traduction]. Parmi eux, hématocoquepluvialis peut accumuler de l’astaxanthine jusqu’à 5% du poids sec dans des conditions de stress. Comme la structure de l’astaxanthine contient deux atomes chiraux de C, la structure chez hématocoquepluvialis est 3S, 3S', et la forme synthétique est un mélange chiral, principalement 3R, 3R'. Haematococcus pluvialis est considéré comme la meilleure source de production naturelle d’astaxanthine.

Haematococcus pluvialis forme une paroi extérieure gélatineuse en forme de coquille après un stress. Lorsque le pigment dans les cellules est extrait, il est difficile pour les solvants conventionnels d’entrer à l’intérieur des cellules pour extraire le pigment. Il est généralement nécessaire de combiner une méthode de rupture de la paroi cellulaire. Deuxièmement, l’astaxanthine dans les cellules d’haematococcus pluvialis existe principalement sous forme d’Les estersd’astaxanthine, c’est-à-dire de molécules monoester et de molécules diester avec différentes chaînes d’acyle. L’analyse HPLC est difficile à réaliser la séparation de base de toutes les molécules, et le poids moléculaire est différent lors du calcul du contenu.

In addition, l’astaxanthineis unstable Et en plusprone to degradation under conditions such as light Et en plusheat, so there are certadansproblems with Le conseil des ministresaccurate determination De laastaxanthin. This paper reviews Le conseil des ministrescurrent research status in terms De lathe extraction, hydrolysis Et en plusdetection De l’astaxanthineÀ partir deHaematococcus pluvialis, with a view to providing guidance on the selection De laappropriate Méthodes de travailfor the rapid determination of l’astaxanthinecontent in Haematococcus pluvialis for different purposes.

1 Extraction d’astaxanthine de Haematococcus pluvialis

L’extractionde l’astaxanthine est la base pour la détermination précise de son contenu et est également l’un des aspects incertains de la mesure de l’astaxanthine. Dans des conditions de stress, les cellules d’haematococcus pluvialis accumulent de l’astaxanthine, mais leur croissance et leur division s’arrêtent, formant des spores immobiles, c’est-à-dire des cellules gélatineuses. Les cellules gélatineuses matures ont une paroi cellulaire dure et épaisse à trois couches, la couche la plus extérieure étant l’algaène, un matériau très résistant à l’hydrolyse de l’acide acétique. Les deuxième et troisième couches sont composées de mannose et de cellulose réparties uniformément et non uniformément [7].

Pour Haematococcus pluvialis à paroi cellulaire gélatineuse, les méthodes conventionnelles de dissolution et d’extraction ne peuvent pas accéder à l’intérieur de la cellule pour extraire le pigment.

At present, in the industry, supercritical CO2 extraction technology [7], high pressure/ultra-high pressure homogenization extraction technology [8], Et en plusnégatifpressure cavitation method [9] are used to Extrait d’astaxanthinefrom Haematococcus pluvialis. The above methods can effectively Extrait extraitastaxanthin, but they require a large amount of algal powder and are complicated to operate, so they are suitable for large-scale industrial production. The extraction methods used to detect l’astaxanthinein Haematococcus pluvialis include solvent extraction, mechanical grinding + solvent extraction, dimethyl sulfoxide (DMSO) extraction, and cellulase wall breaking + solvent extraction.

1.1 méthode d’extraction au solvant

La méthode d’extraction au solvant est facile à utiliser, peu coûteuse et nécessite peu d’équipement. Il suffit d’optimiser le solvant d’extraction, le rapport liquide-solvant, la température d’extraction et le temps d’extraction. Les solvants couramment utilisés sont l’acétone [10], l’acétate d’éthyle, le dichlorométhane, l’éthanol, etc. Cependant, en raison de la paroi externe de la coquille gélatineuse d’haematococcus pluvialis, les solvants conventionnels ne peuvent pas pénétrer dans les cellules et le taux d’extraction de l’astaxanthine est faible. Mendes-Pinto et al. ont signalé que l’acétone était utilisée comme solvant d’extraction de l’astaxanthine d’haematococcus pluvialis et que le taux d’extraction n’était que de 4 mg ·g-1 (masse d’astaxanthine extraite par gramme de poudre d’algues), tandis que le broyage mécanique + extraction d’acétone était de 19 mg ·g-1, ce qui indique que le solvant ne pouvait pas pénétrer dans les cellules pour extraire l’astaxanthine [10].

Ruen-ngam compared solvent extraction methods assisted by ultrasound (Ultrasound Assisted Extraction), microwave (Microwave Assisted Extraction), and Soxhlet (Soxhlet Extraction). The extraction rate De l’astaxanthinereached 74% En utilisantmicrowave assisted extraction at 75 °C for 5 min [11]. In addition, to enhance the extraction efficiency of the solvent, chemical cell wall perturbationinvolves treating Haematococcus pluvialis cells with acids or alkalis. Sarada et al. reported that treating the cells with 2 mol·L-1 hydrochloric acid solution at 70 °C for 2 min, followed by extraction with a solvent, can achieve an astaxanthin extraction rate of 86%–94% [12]. However, it is worth noting that placing astaxanthin in a high concentration of acid or alkali solution can easily cause degradation of astaxanthin. The above results show that due to the special cell wall composition of Haematococcus pluvialis, direct solvent extraction cannot enter the cells, while auxiliary ultrasound, microwave and acid-base treatments are all prone to cause degradation of astaxanthin and are not suitable for astaxanthin extraction.

1.2 rupture mécanique de la paroi cellulaire + extraction au solvant

La rupture mécanique de la paroi cellulaire est la méthode la plus couramment utilisée en laboratoire, qui utilise des forces externes pour briser les parois cellulaires d’haematococcus pluvialis. Dans la norme nationale pour la détection de l’astaxanthine dans Haematococcus pluvialis GB/T 31520-2015 [13] [en], Haematococcus pluvialis est soigneusement broyé à l’aide d’un homogénéisateur de verre, et ses pigments sont extraits à l’aide du dichlorométhane-méthanol comme solvant. La méthode de broyage mécanique + extraction au solvant est plus couramment utilisée dans la détection de l’astaxanthine [10, 14-16]. L’écrasement mécanique peut endommager les parois cellulaires et le pigment peut être complètement extrait. La méthode est simple à utiliser, mais elle exige que chaque échantillon soit broyé à travers un homogénéisateur de cellules, ce qui est long et laborieux.

1.3 rupture de la paroi de la Cellulase + extraction au solvant

Since the cell wall of Haematococcus pluvialis is mainly composed of substances such as cellulose, pectin and lipopolysaccharides, cellulase, pectinase and polysaccharidase are used to break the cell wall of Haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. explored a new enzymatic method for extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis [17] [traduction]. Cellulase: enzymatic hydrolysis of algal powder, ethanol extraction. The optimal process conditions for enzymatic extraction are: initial pH of the enzymatic solution 4.5, enzymatic hydrolysis temperature 45 °C, enzyme dosage 1.5%, and enzymatic hydrolysis time 15 h. Under these conditions, the astaxanthin extraction rate was 94.6%, which is 61.5% higher than the traditional direct ethanol extraction method. It has the advantages of low operating temperature, less pollution, low cost, and high extraction rate. It is easy to achieve vertindustrial production, but this method is time-consuming, and high temperatures can also cause degradation of astaxanthin.

1.4 méthode d’extraction DMSO

DMSO a une bonne miscibilité avec divers solvants et une bonne perméabilité aux cellules. Il est souvent utilisé comme activateur de perméation pour les médicaments ou les pesticides et comme agent protecteur dans la cryoconservation des cellules. Seely a d’abord signalé que le DMSO peut être utilisé pour extraire la chlorophylle microalgues et les caroténoïdes [18] [traduction]. Boussiba et al. ont utilisé le DMSO pour extraire les pigments d’haematococcus pluvialis. L’extraction a été effectuée dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min, et le résidu d’algues peut être rendu incolore en répétant l’extraction 2 à 3 fois dans un bain-marie à 70 °C [19], ce qui montre que le DMSO a une bonne perméabilité et peut pénétrer dans les cellules d’haematococcus pluvialis pour extraire complètement l’astaxanthine. L’extraction du DMSO ne nécessite pas de traitement des parois cellulaires d’haematococcus pluvialis, ce qui simplifie grandement le processus d’extraction de l’astaxanthine, et a été utilisée dans la détection de l’astaxanthine [20-21]. En outre, le monde et#39; S grandes entreprises de microalgues, telles que Cyanotech, Fuji au Japon et en Chine.#39; S Green, une société de bioingénierie [8], A tous appliqué la méthode DMSO pour extraire l’astaxanthine d’haematococcus pluvialis à la détection de l’astaxanthine.

L’utilisation de DMSO comme agent de gonflement peut augmenter la perméabilité de la paroi cellulaire, et peut être utilisé comme extractif pour l’astaxanthine de Haematococcus pluvialis, simplifiant le processus de rupture de la paroi cellulaire nécessaire à la détection d’haematococcus pluvialis.

2 hydrolyse des esters d’astaxanthine

L’astaxanthine accumulée dans Haematococcus pluvialis est all-trans 3S, 3S 'configuration, with one hydroxyl group in each endocyclic structure. It is usually esterified with C16, C18 or C20 fatty acids to form Esters d’astaxanthine to stabilize its structure [22]. Most of them are astaxanthin monoesters, accounting for about 75%, astaxanthin diesters accounting for about 20%, and free astaxanthin only accounting for 5% [12, 23]. There are as many as 30 different types of astaxanthin monoesters and diesters in Haematococcus pluvialis [24]. The complexity of astaxanthin esters makes purification and direct and accurate La quantificationproblematic. Therefore, the extracted astaxanthin esters need to be hydrolyzed into free astaxanthin to achieve purification of a single substance and accurate quantification by HPLC. There are generally two methods for hydrolyzing astaxanthin esters: saponification and enzymatic hydrolysis.

2.1 Saponification

La Saponification est généralement effectuée dans une solution de NaOH ou de KOH méthanol pour hydrolyser les esters d’astaxanthine en astaxanthine libre. Yuan et al. ont montré qu’une concentration élevée d’alcali ou une température de réaction pendant la saponification favorise l’hydrolyse des esters d’astaxanthine, mais accélère également la dégradation de l’astaxanthine [14] [traduction]. Chen Xingcai et al. ont également montré que la concentration d’astaxanthine libre diminuait linéairement avec l’augmentation de la concentration d’alcali [25] [traduction]. Yuan et al. ont étudié la cinétique d’hydrolyse de l’astaxanthine sous saponification à l’ester et la dégradation de l’astaxanthine sous différentes concentrations alcalines. Les résultats ont montré que dans un système de réaction à 22 °C avec une concentration de NaOH de 0,0175 ~ 0,020 mol · L-1, l’ester d’astaxanthine était complètement hydrolysé et aucune dégradation de l’astaxanthine ne se produisait. Cependant, une concentration plus élevée de la solution naoh-méthanol ou une température de réaction plus élevée ont causé une dégradation importante de l’astaxanthine [26] [en]. Les conditions de la méthode de saponification des esters d’astaxanthine sont dures. La concentration de la solution alcaline, la température de saponification et le temps pendant le processus de saponification affectent tous l’efficacité de la saponification et la stabilité de l’astaxanthine, qui est un autre aspect qui affecte la détermination précise de l’astaxanthine.

2.2 méthode d’hydrolyse enzymatique

Zhao reported that a water-soluble alkaline esterase from Penicilium cyclopium can convert astaxanthin esters into astaxanthin. The reaction conditions were incubation at 28 °C with stirring for 7 h, and the récupérationof astaxanthin reached 63.2% [27]. However, this enzyme has low hydrolysis efficiency and has not been widely used in the determination of astaxanthin content. Jacobs first reported that the lipid-soluble cholesterol esterase can rapidly hydrolyze carotenoid esters [28]. Although there are currently few reports in the literature on this enzymatic method, it is used by domestic and foreign companies producing astaxanthin as a gentle method of hydrolysis. The cholesterol esterase used not only completely hydrolyzes the astaxanthin ester, but also does not easily cause oxidation of astaxanthin, which can more accurately determine the astaxanthin content.

L’utilisation du cholestérol estérase sur l’extrait d’haematococcus pluvialis contenant de l’astaxanthine pendant une courte période améliore considérablement l’efficacité de détection de l’astaxanthine dans Haematococcus pluvialis.

3 détection Quantitative de l’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis

Les principales méthodes de détection de l’astaxanthine sont la spectrophotométrie, l’hydrolysis-hplc et HPLC-MS.

3.1 spectrophotométrie

Boussiba reported that chlorophyll in Haematococcus pluvialis was destroyed by heating with 5% KOH-30% methanol solution for about 10 minutes, and then the astaxanthin was extracted with DMSO. The absorbance was measured at a wavelength of 475 nm to calculate the astaxanthin concentration. This method can quickly estimate the astaxanthin content and is widely used in cultivation and production [12, 29]. However, some reports have shown that the treatment of the alkali solution to destroy the chlorophyll in this method causes 25% to 40% degradation of astaxanthin [16] [traduction].

Par conséquent, Li et al. ont amélioré Boussiba&#Procédé 39; S par extraction directe de DMSO sans traitement alcalin et détection à une longueur d’onde de lumière visible de 530 nm pour éviter l’interférence d’autres caroténoïdes et de la chlorophylle. Cette méthode a été utilisée pour la détection rapide de la teneur en astaxanthine chez Haematococcus pluvialis [16]. Geng Jinfeng&#Les recherches montrent que la teneur en caroténoïdes et en astaxanthine d’haematococcus pluvialis pendant le processus de culture est en relation linéaire stable. En utilisant une méthode qui mesure directement et facilement les caroténoïdes et obtient indirectement la teneur en astaxanthine, la teneur en caroténoïdes peut être rapidement déterminée, puis en se basant sur la corrélation entre les caroténoïdes obtenus et l’astaxanthine, la teneur en astaxanthine dans Haematococcus pluvialis peut être rapidement calculée. Les données de ce laboratoire montrent également qu’il existe une bonne relation linéaire entre la teneur en caroténoïdes mesurée par spectrophotométrie et la teneur en astaxanthine mesurée par hydrolyse-hplc enzymatique (Figure 1). Ainsi, la méthode d’extraction DMSO peut être directement utilisée pour déterminer la teneur en astaxanthine en utilisant la méthode spectrophotométrique à 475 nm et la relation de la Figure 1.

3.2 méthode de l’hydrolysis-hplc

After the Haematococcus pluvialis pigment is pretreated by saponification or enzymatic hydrolysis, HPLC can be used to accurately determine the free astaxanthin. At present, the national standard for astaxanthin determination GB/T 31520-2015 uses the method of HPLC after saponification for determination [13]. The separation column is a reverse-phase C30 column, and the detection of all-trans-free astaxanthin, 9-cis- astaxanthin, and 13-cis-astaxanthin can be detected in 20 min. Yuan used a C18 column to analyze astaxanthin esterified with saponin. Methanol/dichloromethane/acetonitrile/water was used as the mobile phase for gradient elution, and a single sample was detected in 16 min [30] [en]. Cyanotech&#La méthode de détermination de la teneur en Haematococcus pluvialis consiste à extraire le pigment puis à l’hydrolyser pour le dosage par CLHP. Ce prétraitement par hydrolyse convertit les esters d’astaxanthine en astaxanthine, qui convertit les composants mélangés contenant des composés d’astaxanthine dans la détection d’un seul composant d’astaxanthine, rendant l’analyse HPLC plus simple, permettant une quantification précise, et avec une haute répétabilité. D’autres conditions de séparation par chromatographie en phase inversée de l’astaxanthine sont résumées dans le tableau 1.

3.3 méthode HPLC-MS

En raison de la diversité et de la complexité de l’extraction de l’astaxanthine et de ses dérivés ester, la spectrophotométrie conventionnelle et les méthodes HPLC ne peuvent pas identifier les différences entre les différentes molécules ester astaxanthine. La spectrométrie de masse peut mieux distinguer entre les différentes molécules en utilisant les différences dans la masse et l’information de fragment entre les molécules d’ester d’astaxanthine, puis effectuer des analyses qualitatives et quantitatives. La méthode de mesure directe de l’échantillon de pigment extrait par HPLC/MS sans traitement évite la dégradation de l’astaxanthine pendant le processus de saponification, et peut mesurer simultanément l’astaxanthine, les esters d’astaxanthine, d’autres caroténoïdes et la chlorophylle.

Il a certaines applications dans la détermination de la composition de l’astaxanthine et l’étude des mécanismes métaboliques de l’astaxanthine. Holtin et al. ont utilisé la MS LC-(APCI) pour analyser qualitativement les isomères libres d’astaxanthine, les monoesters d’astaxanthine, les diesters d’astaxanthine et la lutéine chez Haematococcus pluvialis [24]. Weesepoel et al. ont utilisé ESI-IT et MADIL-TOF/TOF pour effectuer une analyse plus détaillée des esters d’astaxanthine chez Haematococcus pluvialis, y compris la détermination de la chaîne acyle de l’ester d’astaxanthine et la distinction entre les isomères cis et trans [32]. D’autres séparations chromatographiques de l’astaxanthine et de ses dérivés ester sont résumées dans le tableau 1. Il convient de noter que la faible polarité des caroténoïdes et des esters d’astaxanthine rend difficile leur ionisation en utilisant la source d’ions ESI à ionisation douce couramment utilisée. La source d’ions APCI est plus couramment utilisée pour l’analyse des esters d’astaxanthine.

This paper reviews and evaluates the current methods for the extraction, hydrolysis and detection of astaxanthin in Haematococcus pluvialis....... La teneur en astaxanthine est directement mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 475 nm après extraction au DMSO. La teneur en astaxanthine est rapidement calculée sur la base de la relation linéaire entre la teneur en caroténoïdes mesurée par spectrophotométrie et la teneur en astaxanthine mesurée par HPLC. Cette méthode est plus propice à l’obtention rapide de paramètres importants au cours de la recherche. Après l’extraction de DMSO, le cholestérol estérase est utilisé pour l’hydrolyse, et la CLHP est utilisée pour déterminer la teneur en astaxanthine libre, qui peut être utilisée comme méthode pour déterminer avec précision la teneur en astaxanthine. Pour différentes fins de détection, différentes méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse, et la comparaison des données entre différents laboratoires ou méthodes devrait être corrigée en fonction des résultats après le traitement d’hydrolyse de l’échantillon extrait et l’analyse par CLHP.

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