Comment produire de la poudre d’acide hyaluronique par la méthode de Fermentation?

Acide hyaluronique (HA)Est un polysaccharide macromoléculaire qui a été d’abord isolé et purifié de l’humour vitré du bétail par Meyer et d’autres en 1934, d’où son autre nom, hyaluronan [1]. L’acide hyaluronique est un polysaccharide de glucosamine linéaire à rétention homogène composé de 2 000 à 25 000 disaccharides d’acide glucuronique et de n-acétylglucosamine liés alternativement par des liaisons glycosidiques β-1,3 et β-1,3 [2].

L’acide hyaluronique est un composant important de la matrice extracellulaire (ECM) [1]. Des études récentes ont montré que l’acide hyaluronique est non seulement largement présent dans la matrice extracellulaire entre les cellules, mais qu’il existe également à l’intérieur de la cellule, principalement concentré dans le cytoplasme et le noyau des cellules nouveau-nées [2]. En plus d’être trouvé dans le corps vitré, l’acide hyaluronique est également abondant dans le liquide synovial des articulations et dans les espaces entre les cellules épidermiques. En termes de quantité, plus de 50% de l’acide hyaluronique se trouve dans le derme et l’épiderme de la peau, et environ 35% se trouve dans les muscles et les os. On estime actuellement que:Acide hyaluroniqueSe trouve principalement dans le remplissage de l’espace inerte du tissu conjonctif mou, et joue un rôle important dans la formation des complexes de protéoglycan [2].

1 propriétés de l’acide hyaluronique

Sous le microscope électronique,Molécules d’acide hyaluroniqueOn observe qu’ils ont une structure linéaire à chaîne unique, et qu’ils se dilatent en une structure de bobine aléatoire dans une solution aqueuse, avec un diamètre de bobine d’environ 500 nm. Chaque unité disaccharidique de la molécule d’acide hyaluronique contient un groupe carboxyle, qui peut se dissocier dans des conditions physiologiques pour former un anion. La répulsion mutuelle entre les anions à des distances spatiales égales fait en sorte que la molécule se trouve dans un état étendu lâche dans une solution aqueuse, occupant une grande quantité d’espace, de sorte qu’elle peut se lier plus de 1000 fois son propre poids dans l’eau [3].

Selon la source etMéthode d’extraction de l’acide hyaluronique, sa masse moléculaire relative (Mr) est de 8lcpe 105 à 5lcpe 106[4]. La structure et l’activité biologique de l’acide hyaluronique dépendent de sa masse moléculaire relative. L’acide hyaluronique de faible poids moléculaire forme un réseau fragmenté à de faibles concentrations, tandis que l’acide hyaluronique de poids moléculaire élevé forme un réseau complet [3].

En raison des liaisons d’hydrogène dans la molécule,Molécules d’acide hyaluroniqueAdopter une structure à hélice unique en solution aqueuse [5]. Lorsque la concentration d’acide hyaluronique dans la solution atteint un certain niveau, les molécules d’acide hyaluronique interagissent entre elles pour former une structure à double hélice, et une structure en réseau se forme à des concentrations plus élevées [3]. La théorie actuellement acceptée de la structure de l’acide hyaluronique est la théorie de la structure tertiaire, qui stipule que chaque unité trisaccharidique dans une molécule d’acide hyaluronique a une région hydrophobe. Lorsque la concentration en solution est élevée, les régions hydrophobes des molécules d’acide hyaluronique interagissent pour former une structure à double hélice, qui est la base de l’agrégation des molécules d’acide hyaluronique [6].

Acide hyaluroniqueSe caractérise par sa très haute viscosité [2]. Lorsque la viscosité atteint 10 mPa· S après que le Mr et la concentration augmentent, les molécules d’acide hyaluronique commencent à s’entrelacer, à ce moment la viscosité augmente rapidement avec l’augmentation du Mr et de la concentration[3].

2 technologie de Production de poudre d’acide hyaluronique

Il existe trois techniques de production pour la poudre d’acide hyaluronique, à savoir l’extraction, la fermentation microbienne et la synthèse [1].

La méthode d’extraction impliqueExtraction d’acide hyaluroniqueDe tissus humains ou animaux [1]. La méthode d’extraction a été la première méthode utilisée pour produire de l’acide hyaluronique. Actuellement, les principales matières premières utilisées dans la production sont les peignes de poulet, les cordons ombilicaux humains et les yeux d’animaux. Les principales étapes du procédé comprennent l’extraction, l’élimination des impuretés, l’hydrolyse enzymatique, la précipitation et la séparation. Les procédés d’extraction et de purification de l’acide hyaluronique provenant de différents tissus diffèrent dans une certaine mesure [3]. Cependant, en raison de la source limitée de matières premières pour la méthode d’extraction, le taux d’extraction du produit est extrêmement faible (seulement environ 1%), et le processus est complexe, il est donc difficile de réduire les coûts de production. En outre, l’acide hyaluronique étant associé à d’autres substances moléculaires élevées dans les tissus animaux, il est plus difficile de le séparer et de le purifier, et les produits d’acide hyaluronique extraits des tissus animaux peuvent causer des infections. Ces facteurs limitent la large application de la méthode d’extraction dans des industries telles que la médecine et les cosmétiques [2,3].

La méthode synthétique consiste d’abord à synthétiser un"Dérivé d’oxaziridine d’acide hyaluronique«En utilisant une macromolécule biologique, puis en ajoutant de l’eau et de l’hyaluronidase dans les testicules de moutons ou de bovins pour préparer un complexe du dérivé et de l’enzyme, et enfin en éliminant l’enzyme pour purifier l’acide hyaluronique [1]. La méthode synthétique est encore au stade de la recherche en laboratoire et n’a pas encore été appliquée à la production industrielle [1].

La méthode de fermentation microbienne se réfère à l’utilisation de bactéries triées pour effectuer la fermentation et la culture, et le produit d’acide hyaluronique est obtenu en l’isolant et en le purifiant du bouillon de fermentation [1]. En raison des inconvénients susmentionnés de la méthode d’extraction et du fait que la méthode synthétique n’est pas encore mûre, la méthode de fermentation microbienne est devenue la méthode la plus importante pourProduction d’acide hyaluronique....... Ce qui suit est un aperçu plus systématique de la méthode de fermentation microbienne pour produire de la poudre d’acide hyaluronique.

2.1 élevage de bactéries productrices d’acide hyaluronique

Le premier microorganisme découvert àProduire de l’acide hyaluroniqueÉtait Streptococcus pyogenes, qui a été découvert en 1937 pour être capable de produire de l’acide hyaluronique [7]. Par la suite, en 1939, on a découvert que Streptococcus equisimilis et S. zooepidemicus étaient également capables de produire de l’acide hyaluronique [7]. Puisque le streptocoque de type sauvage peut produire de l’acide hyaluronique,  Equisimilis) et Streptococcus zooepidemicus (S. zooepidemicus) se sont également révélés capables de produire de l’acide hyaluronique [7].

Puisque le streptocoque de type sauvage a des inconvénients tels que la capacité de produire de l’hyaluronidase, d’exprimer d’autres protéines extracellulaires, etFaible acide hyaluroniqueProduction [2], les souches sauvages doivent être modifiées par divers moyens dans la production réelle pour répondre aux besoins de la production industrielle.

2.1.1 reproduction par mutagenèse

Les mutagènes comprennent principalement les mutagènes physiques, les mutagènes chimiques et les mutagènes biologiques. A l’heure actuelle, les agents mutagenes utilisés dans l’élevage deSouches produisant de l’acide hyaluroniqueComprennent principalement la lumière ultraviolette, les rayons 60Co γ et la nitroguanidine (NTG) [7]. De nombreux rapports de recherche ont montré que le traitement de certaines souches originales qui peuvent produire de l’acide hyaluronique, comme Streptococcus zooepidemicus et Streptococcus equi, avec divers traitements mutagènes, permet d’obtenir d’excellentes souches avec une production élevée d’acide hyaluronique, ou un poids moléculaire relativement élevé d’acide hyaluronique, ou des réactions négatives après un prétraitement avec de l’hyaluronidase, ou non hémolyse, ou une combinaison des caractéristiques ci-dessus [7].

2.1.2 culture de protoplastes

Comme les protoplastes n’ont pas de paroi cellulaire, ils sont plus sensibles aux changements des conditions environnementales que les cellules ordinaires et réagissent plus fortement aux traitements mutagènes [7]. Des expériences réussies ont été réalisées en utilisant des mutagènes chimiques comme le NTG ou des mutagènes physiques comme les lasers pour traiter des protoplastes de souches originales afin d’obtenir des souches à haut rendement [7].

2.1.3 génie génétique

Le gène codant pour l’enzyme impliquée dans laSynthèse de l’acide hyaluroniqueLa voie dans Streptococcus est situé sur une seule transcriptase inverse et est appelé l’opéron has. Chez Streptococcus pyogenes, l’operon has se compose de trois gènes: hasA (1248 bp), codant pour la synthase de l’acide hyaluronique (42,0 U), hasB (1204 bp), codant pour l’udp-glucose déshydrogénase (47,0 U), et hasC (915 bp), codant pour l’udp-glucose pyrophosphorylase (33,7 U) [2]. Bien qu’il ne soit pas encore clair comment les chaînes d’acide hyaluronique sont transportées à travers la membrane cellulaire, l’expression de l’acide hyaluronique synthase et de l’udp-glucose déshydrogénase chez Enterococcus faecalis, Escherichia coli et Bacillus subtilis est suffisante pour diriger la production et le transport d’acide hyaluronique [2]. L’acide hyaluronique peut donc être produit simplement en transférant les gènes hasA et hasB dans la cellule hôte et en les faisant exprimer dans la cellule hôte [7].

Le gène de synthèse HA de la souche gazeuse muqueuse S43/192/4 du groupe A de Streptococcus agalactiae A d’abord été cloné et construit dans un plasmide Escherichia coli en 1993, puis exprimé avec succès dans E. coli pour synthétiser HA [8]. Par la suite, le gène de synthèse HA du groupe C de Streptococcus agalactiae a été cloné et exprimé dans E. coli en 1997 [8].

Ling Min et al. [9] ont amplifié le gène sqhas de l’adn total de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, a construit un plasmide d’expression et l’a transformé en E. coli DH5α, a exprimé avec succès la protéine sqHAS, et a synthétisé HA en présence d’un substrat. Zhang Jinyu et al. [10] ont cloné le gène hasB de Streptococcus zooepidemicus et l’ont exprimé dans E. coli pour obtenir la protéine correspondante.

Le groupe de recherche Chien de la Province de taïwan en Chine a introduit les gènes hasA et hasB de Streptococcus zooepidemicus dans Lactococcus lactis par le biais du système d’expression inducible NICE, et a obtenu avec succès une soucheProduit de l’acide hyaluronique[11].

Sheng Juyu[12] a introduit le gène de synthase de Streptococcus zooepidemicus hyaluronan dans Lactococcus lactis par le biais du système d’expression inductible NICE (nisin-controlled gene expression system) et l’a exprimé avec succès pour synthétiser l’ha.

2.2 optimisation des conditions de fermentation

Les streptocoques sont des bactéries aux besoins nutritionnels exigeants qui doivent se développer sur des milieux riches en nutriments. Les streptocoques poussent généralement sur des milieux complexes contenant un mélange de levure ou d’extraits d’animaux, de peptone et de sérum. La formulation de ces milieux comprend toujours du glucose (10-60 g/L), des acides aminés, des nucléotides, une grande quantité de sel, des oligo-minéraux et des vitamines [2].

Le pH et la température sont très importants pour la croissance de Streptococcus zooepidemicus et laProduction d’acide hyaluronique....... Certaines études ont montré que les conditions de pH 6,7 ± 0,2 et de température 37 °C conviennent le mieux à la croissance de Streptococcus zooepidemicus et à la production d’acide hyaluronique [13]. La vitesse d’agitation influe également sur la production d’acide hyaluronique. Des études ont montré que dans des conditions de faibles taux d’agitation, la production d’acide lactique est élevée et la production d’acide hyaluronique est faible [13]. L’agitation à grande vitesse peut réduire l’effet de la synthèse de l’acide lactique et augmenter la production d’acide hyaluronique, mais elle peut également détruire les polymères d’acide hyaluronique et réduire leur masse moléculaire relative [13]. La concentration initiale de glucose a un effet significatif sur la masse moléculaire relative de l’acide hyaluronique. La recherche montre que lorsque la concentration initiale de glucose est augmentée de 20 g/L à 40 g/L, la masse moléculaire relative de l’acide hyaluronique augmente également de (2,1 ± 0,1) hk106 à (3,1 ± 0,1) hk106 [13].

Liu et al. [14] ont signalé que pendant la fermentation en lot de Streptococcus zooepidemicus, du peroxyde d’hydrogène (1,0 mmol/g HA) et de l’acide ascorbique (0,5 mmol/g HA) ont été ajoutés à 8 h et à 12 h, respectivement, pour provoquer le redox.Dépolymérisation de l’acide hyaluronique, entraînant une diminution de la masse moléculaire relative et une augmentation du rendement de 5,0 g/L à 6,5 g/L.

3 Applications de l’acide hyaluronique

En raison des nombreusesPropriétés de l’acide hyaluroniqueMentionné ci-dessus, il a été largement utilisé dans de nombreux domaines. Ce qui suit résume principalement l’application de l’acide hyaluronique dans les cosmétiques, les produits de santé et les domaines médicaux et pharmaceutiques.

3.1 Application de l’acide hyaluronique dans les cosmétiques

Acide hyaluroniqueSe trouve principalement dans la matrice extracellulaire entre les cellules, où il a pour fonction de maintenir l’espace extracellulaire des cellules tissulaires, d’accélérer le flux de nutriments, et de maintenir le tissu. Tout d’abord, par rapport aux hydratants traditionnels, l’acide hyaluronique a un meilleur effet hydratant et a les avantages d’être non gras et de ne pas obstruer les pores. Deuxièmement, une solution aqueuse d’acide hyaluronique a une forte viscoélasticité et lubricité, qui aide à former un film hydratant respirant sur la surface de la peau pour garder la peau hydratée. Troisièmement, de petites molécules d’acide hyaluronique peuvent entrer dans le derme, favoriser la microcirculation sanguine et aider la peau à absorber les nutriments, qui peuvent avoir un effet cosmétique et bénéfique pour la santé. Enfin, l’acide hyaluronique peut éliminer les radicaux libres d’oxygène actifs dans la peau causés par le rayonnement ultraviolet, fournissant une protection solaire et la réparation [15].

En raison des nombreusesAvantages de l’acide hyaluronique, il est largement utilisé dans les cosmétiques comme le facteur hydratant naturel idéal pour hydrater, émollient, anti-rides et crème solaire. Le montant habituel d’addition est de 0,05% à 0,50% [15].

3.2 Application de l’acide hyaluronique dans les produits de santé

depuisL’acide hyaluronique a diverses propriétésComme la rétention d’eau, la lubrification, la promotion de la cicatrisation des plaies et la protection des cellules, une diminution de l’acide hyaluronique dans le corps peut conduire à de nombreux problèmes tels que l’arthrite, le vieillissement de la peau, et l’augmentation des rides. Par conséquent, la supplémentation orale d’acide hyaluronique pour compléter l’acide hyaluronique endogène est actuellement considérée comme l’un des moyens efficaces de maintenir la beauté et la santé et de prolonger la vie [16].

La base théorique pourAcide hyaluronique oralEst qu’après la digestion orale, l’acide hyaluronique peut augmenter les précurseurs pour la synthèse de l’acide hyaluronique dans le corps, augmentant ainsi la quantité d’acide hyaluronique synthétisé dans le corps et ciblant les tissus tels que la peau pour exercer son effet. À l’heure actuelle, divers produits d’acide hyaluronique oral ont été lancés, comme des comprimés, des capsules et des liquides oraux [16].

3.3 Application de l’acide hyaluronique dans le traitement médical

L’acide hyaluronique est largement utiliséEn ophtalmologie, en orthopédie et dans de nombreux autres domaines médicaux en raison de sa viscoélasticité, de sa biocompatibilité et de sa non-immunogénicité uniques [17].

Pour les maladies oculaires, la voie de traitement préférée est l’administration ophtalmique topique. Pour les médicaments ophtalmiques, la biodisponibilité du médicament est positivement corrélé avec la viscosité du liquide dans une certaine plage. L’augmentation de la viscosité peut prolonger le temps de séjour du médicament dans l’œil et ainsi améliorer l’efficacité. Cependant, certains exhausteurs de viscosité peuvent causer des effets secondaires tels que l’inconfort oculaire. L’acide hyaluronique surmonte cet inconvénient en raison de ses propriétés fluides non newtoniennes et sa bonne biocompatibilité. Il s’agit donc d’un bon agent de viscosité ophtalmique qui mérite d’être développé et appliqué [18]. En plus d’être utilisé dans les gouttes pour les yeux, l’acide hyaluronique peut également être utilisé pour traiter les symptômes de sécheresse oculaire. À l’heure actuelle, l’acide hyaluronique a été utilisé conjointement avec une variété d’autres polymères à haute moléculaire pour améliorer les symptômes de sécheresse oculaire [19].

En plus de sa présence dans le corps vitré, l’acide hyaluronique est également le composant principal du cartilage articulaire et du liquide synovial. Lorsque le corps développe l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde et d’autres maladies articulaires, la production et le métabolisme de l’acide hyaluronique dans l’articulation est anormale, et la concentration et le poids moléculaire relatif de l’acide hyaluronique dans le liquide synovial sont considérablement réduits, ce qui perturbent la dégradation du cartilage. Cela a conduit au développement de la thérapie complémentaire viscoélastique, qui traite les maladies articulaires parComplément d’acide hyaluronique exogène....... Cette thérapie est de plus en plus populaire auprès des médecins et des patients en raison de son efficacité durable et de ses peu d’effets secondaires [20].

En outre, l’acide hyaluronique est également largement utilisé dans les systèmes d’administration de médicaments en tant que divers porteurs (tels que les porteurs de médicaments ciblés anti-tumeur, les vecteurs non viraux pour la thérapie génique, et les porteurs pourPeptide:Et les médicaments protéiques), comme matériaux d’implant en chirurgie, et dans le traitement des ulcères buccaux récurrents [17].

4 perspectives

Comme l’acide hyaluronique est progressivement appliqué dans divers domaines, la méthode de fermentation microbienne pour produirePoudre d’acide hyaluroniqueRemplacera progressivement la méthode d’extraction et deviendra la principale méthode de production industrielle d’acide hyaluronique. Le début de la production d’acide hyaluronique chez un hôte étranger indique que la production d’acide hyaluronique est entrée dans le stade de l’application de la biotechnologie moderne. À l’avenir, des souches pouvant produire de l’acide hyaluronique avec différentes masses moléculaires relatives seront sélectionnées, et grâce à l’optimisation continue des conditions de fermentation, des produits d’acide hyaluronique pouvant être utilisés dans différents domaines seront fournis. L’acide hyaluronique sera également de plus en plus utilisé dans de nombreux domaines.

Références:

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