Comment produire l’ubiquinone Coenzyme Q10 par Fermentation?

Coenzyme Q10 (ubiquinOne-10, Coenzyme Q10, COQ10), également connue sous le nom d’ubiquinone (ci-après dénommée COQ10). Sa formule moléculaire est C59 H90 O4 et son poids moléculaire est 863. La formule structurelle est la suivante:

Coenzyme d’ubiquinone Q10 Est un composé de quinone liposoluble avec des cristaux jaune-orangé à la température ambiante et un point de fusion de 49 ℃, et il est inodore et insipide [1]. Les fonctions physiologiques du COQ10 sont principalement attribuées aux propriétés redox du groupement quinone et aux propriétés physiques de la chaîne latérale de l’isoprénoïde. Des études ont montré que le COQ10 à l’état réduit et les monomères d’isoprène avec toutes les structures trans ont une activité et des effets pharmacologiques plus élevés que le COQ10 à l’état oxygéné et les monomères d’isoprène avec toutes les structures de cis.

Le rôle du COQ10 a été identifié pour la première fois par MOOre et coll., en 1940, mais n’a pas attiré beaucoup d’attention clinique. En 1957, Crane et coll., ont purifié le COQ10 du myocarde bovine et mesuré sa structure chimique, confirmant que le COQ10 joue en fait un rôle important en tant que vecteur redox dans la chaîne de transport respiratoire des mammifères.

Coenzyme d’ubiquinone Q10 Est connu pour être un transporteur d’électrons liposoluble entre la NADH déshydrogénase, la succinate déshydrogénase et le complexe bc dans la chaîne respiratoire, et c’est un élément générateur d’énergie cellulaire, c’est donc un antioxydant naturel et un activateur du métabolisme cellulaire, et il est important dans le traitement des maladies cardiovasculaires, et il peut améliorer l’immunité humaine et traiter les maladies du système immunitaire humain. Comme antioxydant naturel, il peut être utilisé dans les soins de santé et de beauté [2]. En Chine, l’utilisation de capsules de COQ10 augmente d’année en année, mais les matières premières dépendent essentiellement des importations, ce qui nécessite la production nationale de grandes quantités de matières premières et de préparations bon marché de COQ10.

1 méthode de Production COQ10

Le COQ10 est largement présent dans les tissus végétaux et animaux ainsi que dans les organismes microbiens. Les organismes microbiens contiennent généralement des concentrations élevées de COQ10, tandis que les tissus végétaux et animaux en contiennent de faibles concentrations, ce qui fait des microorganismes une bonne source de COQ10.

Coenzyme d’ubiquinone Q10 Peut être préparé par trois méthodes: l’extraction de tissus animaux et végétaux, la fermentation microbienne et la synthèse chimique. À l’heure actuelle, l’extraction de tissus animaux et végétaux est principalement utilisée en Chine. Les pays d’outre-mer utilisent principalement la fermentation microbienne, en particulier au Japon, où la production industrielle de COQ10 par fermentation microbienne a été réalisée dès 1977.

La méthode de synthèse chimique est caractérisée par des conditions difficiles et de nombreuses étapes; En outre, la plupart des monomères d’isoprène du COQ10 sont des structures de la cs, qui ne sont pas biologiquement actives, et la teneur en sous-produits est élevée, de sorte que le coût de purification est élevé. La méthode d’extraction des tissus animaux et végétaux est principalement basée sur les résidus du cœur de porc après extraction du cytochrome C. La teneur en COQ10 dans les tissus animaux est faible, avec un rendement de seulement 75 mg par kg de cœur de porc frais [3], et la production à grande échelle est limitée par la limitation des matières premières et des sources.

En revanche, la production de Coenzyme d’ubiquinone Q10 Par la fermentation microbienne a plusieurs avantages de base: (1) (1) le produit de fermentation est naturel, biologiquement actif, et facilement absorbé par le corps humain; (2) (2) il n’y a aucune limitation des matières premières, et la capacité de production peut être augmentée par scale-up. Cependant, son contenu limité, son faible rendement et son coût de production élevé limitent dans une certaine mesure l’industrialisation. Si nous pouvons choisir des souches appropriées pour la modification génétique, sélection directionnelle de souches avec d’excellentes performances, afin d’augmenter le contenu de COQ10 dans la bactérie, le coût de production sera considérablement réduit.

2 progrès dans la Fermentation microbienne pour la Production de COQ10

2. Les droits de l’homme 1 sélection de souches

Malgré la teneur élevée en COQ10 dans les organismes microbiens dans la nature, les produits de fermentation sont un mélange de divers congénères de COQ10, ce qui entraîne un coût élevé de purification du COQ10. Par conséquent, la sélection des souches pour la fermentation du COQ10 est d’une importance primordiale. Les microorganismes utilisés dans la fermentation du COQ10 sont énumérés dans le tableau 1.

Tableau 1 teneur en COQ10  Dans les organismes microbiens [4]

Le tableau ci-dessus montre que la teneur en COQ10 dans le corps des bactéries photosynthétisantes (ci-après dénommées PSB) était généralement élevée. En termes de statut taxonomique, les PSB appartiennent au phylum Bacteroidetes, qui est divisé en le subphylum rhodobactéries et le subphylum Green Thiobacteria, et le premier est divisé en les familles rhodobactériaceae et rhodobactériaceae; R. capsulatus et R. sphaeroides appartiennent à la famille des rhodobactériaceae, qui est l’un des choix idéaux pour les souches productrices de coq10.

2. Les droits de l’homme 2 Modification génétique des souches

Le Coenzyme Ubiquinone Q10 La capacité de production des souches de type sauvage n’est pas suffisante pour répondre aux besoins de production et peut être génétiquement modifiée à l’aide de techniques conventionnelles de mutagénèse et de génie génétique. 

2. Les droits de l’homme 2. Les droits de l’homme 1 Élevage pour la régulation métabolique du COQ10

En 1976, Rudney a proposé lors d’une conférence internationale sur le COQ10 que la voie de synthèse microbienne du COQ10 soit principalement divisée en voies de biosynthèse de la synthèse des anneaux aromatiques et de la chaîne latérale de l’isoprényle. Selon la voie de biosynthèse du cycle aromatique et de la chaîne latérale de l’isoprényle combinée au mécanisme de régulation métabolique des bactéries, la voie de sélection pour la sélection de souches à haut rendement de COQ10 dans la fermentation industrielle peut être divisée en ce qui suit:

(1) Sélection et sélection de souches mutantes déficientes en nutriments

OlsOn et Rudney [5] ont constaté que les caroténoïdes et le COQ10 sont anabolisés par le polyisoprène comme précurseurs, et que la réduction de la production de caroténoïdes peut favoriser la biosynthèse du COQ10. Par conséquent, la sélection d’une souche PSB mutante verte pourrait augmenter la teneur en COQ10. YOshida et al. [6] ont mutagène R. sphae- roides Ky-4113 et ont obtenu une souche mutante verte avec une augmentation de 10 à 20% de la teneur en COQ10 par rapport à la souche sauvage.

(2) Sélection et élevage de souches mutantes résistantes aux antagonistes métaboliques

L’élimination des inhibiteurs de la synthèse du COQ10 ou de son anabolisme connexe a augmenté les niveaux de COQ10. YOshida et al. [6] ont examiné les souches mutantes à la recherche de précurseurs, d’inhibiteurs et de leurs analogues structuraux (éthylthionine, l-méthionine, méthylnaphthoquinone et daunorubicin) contre la synthèse du COQ10 et ont obtenu des souches mutantes d’agrobacterium tume "aciens avec des concentrations de 10 à 20% plus élevées que les souches sauvages. La souche mutante d’aciens était de 10 à 20% plus élevée que la souche sauvage.

D’autres souches de mutants combinatoires, telles que les souches de mutants déficients en nutriments et les souches de mutants doubles résistantes aux analogues structurels, peuvent être sélectionnées selon plusieurs voies pour augmenter considérablement le rendement du produit cible.

2. Les droits de l’homme 2. Les droits de l’homme 2 construction de souches génétiquement modifiées

En utilisant la technologie de la biologie moléculaire pour trouver le gène d’enzyme clé de la souche de production de COQ10, et en introduisant ce gène dans la souche de production par la technologie de l’adn recombinant, afin d’augmenter le numéro de copie du gène d’enzyme clé et de l’express efficacement, améliorant ainsi la capacité de synthétiser l’ubiquinone Coenzyme Q10, c’est la voie de base pour construire la souche de fermentation de COQ10 recombinant.

L’étape limitant le taux de biosynthèse du COQ dans différents organismes est la condensation de l’acide hydroxybenzoïque avec le polyisoprène catalysé par l’enzyme paraben polyisoprène pyrophosphotransférase. Des études sur cette enzyme ont montré qu’elle a une spécificité de substrat relativement large [7]. Sur la base de ce principe, le gène ubiA a été cloné à partir d’e. coli et introduit dans PSB, et l’expression de ce gène a été améliorée pour obtenir une souche de COQ10 à haut rendement.

D’autre part, puisque la PSB n’est pas un récepteur mature pour le génie génétique, la recherche d’une voie métabolique utilisant E. coli comme récepteur a été tournée vers. La longueur des chaînes latérales des principaux composants du COQ est contrôlée par des gènes (p. ex., E. coli ispB, enzyme coq1, bactérie photosynthétique dds1, etc.), qui sont différents dans différentes cellules de différents organismes en raison des différents gènes contrôlant la longueur des chaînes latérales. E. coli est simple à cultiver à haute densité et possède un système bien établi pour l’expression de gènes exogènes, mais le principal composant du COQ synthétisé par E. coli est le COQ8.

Par conséquent, il est concevable de clore le gène contrôlant la longueur de la chaîne latérale de COQ10 (dds1) de PSB et de l’introduire dans les cellules d’e. coli, et en même temps d’inactiver ispB, le gène de contrôle de la chaîne latérale de COQ8, afin de réaliser la production à grande échelle de COQ10 dans E. coli recombinant. Actuellement, ShOkuhin et al. ont montré qu’il est possible de synthétiser le COQ10 dans E. coli [8,9].

2. Les droits de l’homme 3 optimisation des Conditions de Fermentation

En plus de l’application de la théorie du contrôle métabolique pour sélectionner et élever des souches mutantes à haut rendement ou construire des souches recombinantes pour améliorer le rendement de fermentation, l’optimisation des conditions de fermentation des bactéries de producteur est également un moyen important et efficace d’améliorer le rendement de fermentation.

2. Les droits de l’homme 3. Les femmes 1 optimisation du milieu de Culture

Dans l’ubiquinone Coenzyme Q10 Des expériences de fermentation et d’optimisation ont été réalisées en sélectionnant différentes sources de carbone, d’azote, de facteurs de croissance et de sels inorganiques pour déterminer la composition du milieu de culture. Il a été démontré que les ions métalliques, en particulier Mg2+, Fe2+ et Mn2+, peuvent favoriser la production de COQ10 par fermentation de R. sphaeroides. L’ajout de 12. 2 mmOl/L mgso4,1. 8 mmOl/L FeSo4  ·7H2 O,0. 9 mmOl/L MnSo4 -7H2 O a augmenté le rendement de COQ10 de 2,0 mg/g de poids sec à 2,0 mg/g de poids sec.0 mg/g de poids sec à 8. 9 ~ 9. 6 mg/g de poids sec (Asahi Chemical Industry CO., Ltd., Ja- pan, 1981). En outre, les précurseurs peuvent augmenter considérablement le rendement du produit et, dans certaines conditions, contrôler le flux de produits anabolisants dans la bactérie. Les précurseurs qui ont été ajoutés à la production de la fermentation du COQ10 sont l’acide p-hydroxybenzoïque, l’acide mévalonique, l’isopentenol et le géraniol [10].

2. Les droits de l’homme 3. Les femmes 2 optimisation des Conditions de Culture

(1) mixage-aération

L’effet de l’agitation et de l’aération sur la production de CoQ10 varie selon la souche, l’une favorisant la production de CoQ10 [11] et l’autre l’inhibiant [4, 12]. Selon les études existantes, l’agitation et l’aération sont défavorables à la production de CoQ10 par R. sphaeroides. Sakato et al. ont étudié l’effet de l’agitation et de l’aération sur la production de CoQ10 en utilisant la fermentation Ky8598 de R. sphaeroides pour la production de CoQ10 [13]. Les résultats ont montré que la meilleure croissance bactérienne était atteinte lorsque le potentiel redox (ORps) était de - 150 mM, et la production la plus élevée de CoQ10 était atteinte lorsque le ORps était de - 200 mM, c’est-à-dire que la restriction de l’approvisionnement en oxygène était favorable à la croissance bactérienne et à la production de CoQ10.

Sur la base de l’étude ci-dessus, Yoshida et al. ont observé l’effet de l’apport en oxygène sur la microstructure de R. sphaeroides par microscopie électronique [6]. Il a été démontré que la membrane interne du cytoplasme des bactéries cultivées dans des conditions limitées en oxygène était bien développée et avait une structure multicouche, où se trouvait le centre de photoréaction de psB, ce qui pourrait conduire à une teneur plus élevée en CoQ10 que celle des bactéries cultivées dans des conditions bien oxygénées.

(2) lumière du soleil

Rhodobacter sphaeroides est capable de photosynthèse bactérienne anaérobie spécialisée ainsi que de respiration et de fermentation aérobies, et Car et ExCell ont signalé que la production de CoQ10 par le BSP est élevée dans des conditions anaérobies à la lumière, mais diminue considérablement une fois que la culture est passée à des conditions aérobies sombres [4].

(3) temps d’incubation

Yoshida et al. ont constaté que la teneur en CoQ10 était plus élevée lorsque les bactéries étaient dans la période de pré-stabilisation [6]. Zhu Xufen et al. ont également constaté que la teneur en CoQ10 dans les bactéries augmentait avec l’augmentation du temps d’incubation, atteignant le niveau le plus élevé au milieu de la période de pré-stabilisation, puis commençait à diminuer [14].

2. Les droits de l’homme 4 Extraction de CoQ10 à partir de cellules microbiennes

Il existe deux méthodes pour extraire le CoQ10 des cellules microbiennes: non saponifiée et saponifiée. L’extraction non saponifiable a l’avantage de ne pas détruire le CoQ10, bien que la quantité d’extrait obtenue soit inférieure à celle obtenue par saponification [15]. La Saponification est la méthode classique d’extraction des substances liposolubles, qui est simple mais coûteuse et est éliminée dans la production industrielle moderne [1,16]. La méthode de saponification alcaline récemment proposée peut éliminer complètement la consommation d’acide gallique pyrogallique et de solvant d’éthanol, et l’utilisation de cellules broyées à l’acide directement saponifiées, de sorte que le coût de production du CoQ10 est considérablement réduit, et il est donc possible d’appliquer à la production de masse industrialisée.

3 perspectives

Actuellement, le prix des produits CoQ10 sur le marché est élevé. Surtout en Chine, la plupart des produits CoQ10 sont importés, ce qui est dû à la faible teneur en fermentation des souches et au faible rendement d’isolement et de purification. Par conséquent, afin de réaliser la production industrielle de CoQ10 par fermentation microbienne, il est nécessaire d’utiliser des méthodes de sélection microbienne conventionnelles et la technologie de l’adn recombinant pour modifier génétiquement les souches de production, augmenter le contenu de CoQ10 intracellulaire, et optimiser la voie d’extraction pour réduire les coûts d’extraction et d’isolement.

Référence:

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